Reconhecimento de marcadores CD de células assassinas induzidas por citocinas humanas por citometria de fluxo

As células assassinas induzidas por citocinas, CIK, são populações heterogêneas de células imunes geradas ex vivo a partir de culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com citocinas específicas e anticorpos monoclonais. As células CIK compreendem populações de células, incluindo células T NK-T CD3+CD56+, células T CD3+CD56- e células NK CD3-CD56+.

Para determinar a proporção da célula CIK, comece com tubos contendo uma suspensão de célula CIK derivada de PBMC. Adicione anticorpos anti-CD3 e anti-CD56 conjugados a diferentes fluoróforos e sua mistura a tubos designados. Adicione anticorpos de controle de isotipo conjugados a fluoróforos semelhantes como anticorpos específicos em outros tubos.

Os anticorpos anti-CD3 e anti-CD56 marcados com fluorescência reconhecem e se ligam a CD3 e CD56 expressos em populações de células CIK, respectivamente. Os anticorpos de controle de isotipo não têm especificidade do antígeno alvo, facilitando medições de sinal de fundo não específicas.

Pipete as células em tubos de fundo redondo com tampas de filtro de células, que ajudam na remoção de agregados celulares. Carregue os tubos em um carrossel de citômetro de fluxo. Durante a corrida, cada célula passa pelo canal e encontra os feixes de laser, espalhando a luz.

Um detector mede a intensidade da luz espalhada para frente, indicativa do tamanho da célula; outro mede a intensidade da luz espalhada lateral perpendicular ao feixe de laser, sugestiva de granularidade celular. Juntas, essas informações ajudam a identificar a população de células imunológicas.

Simultaneamente, feixes de laser de comprimentos de onda de excitação específicos excitam os anticorpos conjugados com fluoróforo nas células, causando emissões de sinal fluorescente que são detectadas.

A análise de intensidades fluorescentes específicas nas células determina a proporção de subpopulações de células CIK.

Comece este procedimento com a preparação das células CIK, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, lave as células CIK com 10 mililitros de PBS estéril. Centrifugue por 10 minutos a 300 vezes g e 18 a 20 graus Celsius. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 5 mililitros de PBS. Conte o número de células e teste a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano.

Aliquotar as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mililitro a uma densidade de aproximadamente 0,5 a 1 milhão de células por mililitro de PBS. Rotule e trate as células, conforme detalhado no protocolo de texto. Misture suavemente as células CIK com os anticorpos, pipetando suavemente para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de 1 mililitro. Incube as células por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Centrifugue os tubos durante 10 minutos a 300 vezes g e 18 a 20 graus Celsius. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mililitro de PBS. Em seguida, pipete suavemente as células para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de 1 mililitro. Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de poliestireno de 5 mililitros com uma tampa de filtro de célula, pipetando suavemente através da tampa. Em seguida, coloque os tubos no carrossel em ordem.

Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental. Em seguida, clique no botão "Novo espécime" para adicionar um espécime e um tubo ao experimento. Nomeie os tubos conforme listado no protocolo de texto.

Para criar um sistema de controle de dispersão para as populações de células CIK, primeiro selecione o tubo 1 e clique no botão Dot Plot para criar um gráfico FSC-A/SSC-A. Desenhe uma porta retangular sobre toda a população de células com um limite FSC-A maior que 5.000 para excluir detritos celulares.

Selecione o parâmetro FSC-A/FSC-H para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de polígono ao redor de todas as células individuais. Selecione o parâmetro contagem versus conjugado com FITC (CD3) e contagem versus conjugado com APC (CD56) para o novo gráfico de histograma. Selecione o parâmetro conjugado com FITC (CD3) versus conjugado com APC (CD56) para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.

Registre os dados de 20.000 células individuais em cada amostra. Clique no botão "Carregar amostra" para analisar primeiro a amostra de controle em branco. Identifique toda a população de células CIK usando os parâmetros dos canais CD56 e CD3. Abra os arquivos que contêm os valores estatísticos da amostra individual para analisar as populações de células CIK e reimprima-os em arquivos de análise.