Ensaio para a identificação da secreção de interferon-gama em órgãos linfóides murinos

O interferon-gama, ou IFN-γ, uma citocina secretada pelas células T dos linfócitos e células assassinas naturais ou células NK, medeia a resposta imune contra patógenos.

Para estudar in situ a produção de IFN-γ, pegue um camundongo transplantado com células T marcadas com fluorescência projetadas para expressar um receptor que reconhece a ovalbumina - um antígeno modelo.

Pegue uma suspensão de bactérias patogênicas - geneticamente modificadas para expressar ovalbumina - e injete-a por via intravenosa no camundongo, causando uma infecção sistêmica. As bactérias circulantes atingem o baço - um órgão linfóide secundário - que auxilia na remoção de patógenos, facilitando a interação com as células imunológicas.

As células apresentadoras de antígenos engolfam as bactérias e exibem o antígeno. As células T se ligam ao antígeno por meio de seu receptor, são ativadas e produzem IFN-γ.

As células dos macrófagos, infectadas com a bactéria, liberam mediadores imunológicos e regulam positivamente os ligantes ativadores em sua superfície. Após a interação com esses sinais, as células NK são ativadas e produzem IFN-γ.

Injete um inibidor de transporte de proteína intracelular para restringir a secreção de IFN-γ, causando seu acúmulo intracelular.

Colha o baço do rato. Fixe o lenço e congele-o para ajudar no seccionamento. Usando um criomicrótomo, gere seções finas de tecido e coloque-as em lâminas de vidro. Adicione anticorpos específicos de células NK, que se ligam aos marcadores de superfície, e anticorpos específicos de IFN-γ, que coram o IFN-γ intracelular. Esses anticorpos são marcados com diferentes fluoróforos.

Coloque a lâmina sob um microscópio de fluorescência para detectar IFN-γ dentro das células NK e T.

Descarte a solução fixadora e adicione 5 mililitros de PBS por 5 minutos em temperatura ambiente, sob agitação suave. Em seguida, substitua o PBS por 5 mililitros de sacarose a 30% e incube por 12 a 24 horas para manter a morfologia do tecido. Agora, o órgão afunda na parte inferior da placa.

Para congelar a amostra, coloque gelo seco em um recipiente grande e coloque um recipiente menor dentro, contendo cerca de 50 mililitros de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco. Seque suavemente o baço em um lenço sem fiapos. Goteje uma gota de composto OCT na parte inferior do molde de base e coloque o baço dentro do molde. Tenha cuidado para não produzir bolhas.

Adicione aproximadamente 1 mililitro de OCT sobre o baço. Com uma pinça, deposite o molde base na superfície do metanol no banho de gelo seco, certificando-se de que o metanol não toque na OCT. A OCT vai engrossar e ficar branca quando congelada. Lembre-se de congelar o tecido o mais rápido possível para minimizar os artefatos.

Em um criomicrótomo, ajuste para a temperatura de menos 21 graus Celsius. Corte o tecido na espessura desejada em torno de 10 micrômetros. Use um pincel para coletar seções em lâminas de microscópio de vidro e inspecione visualmente. Deixe as seções atingirem a temperatura ambiente.

Desenhe um círculo com um bloqueador de líquidos, por exemplo, uma caneta PAP, ao redor da seção de tecido fora da OCT. Depois que o tecido secar, reidratar a amostra pingando 100 microlitros de PBS na seção de tecido por 5 minutos. Em seguida, remova o PBS da seção por aspiração e adicione 100 microlitros de solução de bloqueio por seção de amostra. Incubar em câmara úmida coberta por no mínimo uma hora em temperatura ambiente.

Para corar com anticorpos primários, substitua a solução de bloqueio pela mistura de anticorpos primários preparada para cada amostra. Incube por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius em uma câmara úmida coberta, antes de lavar de acordo com o manuscrito.

Agora, dilua os anticorpos secundários de interesse para uma concentração ideal, geralmente 2,5 microgramas por mililitro na solução de bloqueio. Remova a solução de lavagem final da seção e adicione a mistura de anticorpos secundários preparada no topo da seção e incube por uma a quatro horas em temperatura ambiente em uma câmara úmida coberta.

Após a lavagem com tampão de lavagem de acordo com o manuscrito, remova a solução de lavagem e faça uma lavagem final com PBS. Aspire a solução salina tamponada com fosfato e deixe o PBS restante evaporar sem que a seção seque completamente.

Desenhe um círculo ao redor da seção na parte de trás do slide. Em seguida, coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra, certificando-se de que o meio cubra toda a seção e coloque cuidadosamente uma tampa de vidro por cima. Deixe as amostras polimerizarem durante a noite em temperatura ambiente no escuro.

De manhã, coloque a lâmina sob um microscópio de varredura a laser espectral invertido. Ajuste os objetivos para 10x/NA 0,40 ou 60x/NA 1,4 para análise da localização subcelular de citocinas.