Isolamento de células de Sertoli imunorreguladoras de túbulos seminíferos de camundongos

Os túbulos seminíferos dos testículos contêm células de Sertoli, que nutrem as células germinativas. As células de Sertoli são conectadas por meio de junções apertadas e estão firmemente ligadas à matriz basal rica em ácido hialurônico. Este arranjo de células de Sertoli regula a entrada das células imunes no túbulo e protege as células germinativas em desenvolvimento da degradação.

Para isolar as células de Sertoli, comece com um tubo contendo túbulos seminíferos parcialmente digeridos derivados de testículos de camundongos. Esses túbulos não possuem células peritubulares - células musculares lisas ao redor dos túbulos seminíferos.

Trate os túbulos com um coquetel enzimático contendo hialuronidase - essencial para a hidrólise do ácido hialurônico - e DNase.

As hialuronidases entram nos túbulos e clivam o ácido hialurônico - um polissacarídeo basal - iniciando o descolamento das células de Sertoli da matriz basal e liberando células germinativas na solução. A DNase digere quaisquer contaminantes de DNA da solução, evitando a agregação celular.

Lave os túbulos digeridos enzimaticamente com um tampão, removendo enzimas residuais, fragmentos celulares e células germinativas. Ressuspenda os túbulos digeridos e carregue a suspensão em um conjunto agulha-seringa.

Passe a solução repetidamente para criar cisalhamento hidrodinâmico e interromper as junções apertadas das células de Sertoli, liberando-as como células únicas junto com as células germinativas remanescentes.

Filtre a suspensão celular, removendo os detritos celulares e obtendo uma suspensão unicelular. Centrifugue o filtrado para peletizar as células.

Ressuspenda as células em um meio de crescimento sem soro para expansão seletiva das células de Sertoli.

Para isolar as células de Sertoli, use uma nova pipeta de 25 mililitros para ressuspender completamente os túbulos sedimentados em 25 mililitros de PBS. Depois de permitir que os túbulos assentem por mais 12 minutos, use a mesma pipeta para lavar os túbulos mais três vezes da mesma maneira. Em seguida, transfira os túbulos para um novo frasco de 100 mililitros com tampa de rosca e adicione a solução de Hialuronidase-DNase-I. Além disso, digerir os túbulos em banho-maria agitado a 32 graus Celsius por cinco minutos.

Verifique uma alíquota da suspensão por inspeção de microscópio óptico com ampliação de 100x. Túbulos curtos, agregados tubulares e células liberadas devem ser visíveis. Deixe os agregados tubulares assentarem por 10 minutos. Em seguida, use uma nova pipeta de 25 mililitros para remover o sobrenadante e lave os agregados quatro vezes em 25ml de PBS, com 10 minutos de sedimentação entre cada lavagem.

A população de PTC contaminante terá sido reduzida. Após a última lavagem, adicione 20ml de meio RPMI 1640 às células e passe a suspensão por uma agulha 18G montada em uma seringa de 20 mililitros 10 vezes. Em seguida, confirme rapidamente se todos os agregados foram dissociados e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons para obter uma suspensão pura de célula única.

Gire o filtrado, usando a pipeta de 25 mililitros para aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células de Sertoli isoladas em 40ml de meio RPMI 1640 sem soro. Em seguida, conte o número de células viáveis por exclusão de azul de tripano e ajuste a concentração celular para 3 x 10⁶ células por mililitro. Finalmente, alimente 1 mililitro de células por poço em uma placa de seis poços.