Isolamento seletivo de células T CD4⁺ Vδ1⁺ γδ de células mononucleares do sangue periférico humano

As células T γδ expressam receptores de células T, TCRs, compreendendo cadeias gama e delta com domínios variáveis e constantes.

As células T CD4+ Vδ1+ - uma subpopulação de células T γδ - co-expressam a cadeia variável Vδ1 e o co-receptor CD4. Essas células migram para tecidos inflamados e se transdiferenciam em células T CD4+ ou CD8+ αβ funcionalmente maduras – mediando uma resposta imune.

Para isolar as células T CD4+ Vδ1+ das células mononucleares do sangue periférico humano, PBMCs, ressuspenda as células em um tampão. Use um reagente bloqueador de Fc para bloquear os receptores Fc da superfície celular e evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Adicione anticorpos anti-Vδ1 conjugados com o fluoróforo FITC, que se ligam aos antígenos Vδ1 das células T γδ. Incube com microesferas magnéticas acopladas a anticorpos anti-FITC, que se ligam ao corante FITC nos anticorpos ligados às células T Vδ1.

Passe a mistura através de uma coluna magnética para atrair as células T Vδ1+ ligadas ao grânulo; as células T Vδ1- permanecem não ligadas e são subsequentemente liberadas. Lave a coluna com força empurrando o buffer através dela para separar as células T Vδ1+.

Incube as células com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD4, que se ligam ao co-receptor CD4 das células. Coloque o tubo em um ímã para atrair as células T CD4 + Vδ1 + ligadas ao grânulo; as células T CD4-Vδ1+ permanecem não ligadas.

Ressuspenda as células T CD4+ Vδ1+ em um meio. Adicione um reagente de desprendimento de esferas para liberar as esferas das células. Substitua o tubo no ímã para separar as contas.

Colete o sobrenadante de células CD4+ Vδ1+ para análise posterior.

Antes de iniciar o isolamento de células T Vδ1, use uma alíquota 1 x 10⁶ do PBMC para avaliar a frequência de células T positivas para Vδ1CD4 na amostra do doador por citometria de fluxo. Em seguida, gire o resto dos linfócitos e ressuspenda o pellet em 60 microlitros de tampão MACS por 1 x 10⁷ células.

Em seguida, bloqueie as células em 20 microlitros de reagente bloqueador de Fc por 1 x 10⁷ células, seguido pela adição de 10 microlitros de anticorpo anti-Vδ1 humano conjugado com FITC por 1 x 10⁷ células por 12 minutos a 4 graus Celsius no escuro. No final da incubação, lave as células em 14 mililitros de tampão MACS.

Ressuspenda o pellet em 80 microlitros de tampão MACS por 1 x 10⁷ células e adicione 20 microlitros de microesferas anti-FITC por 1 x 10⁷ células com mistura. Após 15 minutos no escuro a 4 graus Celsius, lave as células em 10 mililitros de tampão MACS fresco.

Durante a centrifugação, equilibre uma coluna magnética pré-resfriada com 500 microlitros de tampão MACS. Em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão MACS e adicione-as cuidadosamente ao topo da coluna.

Enxágue a coluna com três lavagens tampão MACS de 500 microlitros. Em seguida, remova a coluna do ímã e use um êmbolo para lavar rapidamente as células positivas para Vδ1 com 1 mililitro de tampão MACS em um tubo cônico de 15 mililitros.

Depois de passar as células por uma segunda coluna, faça um vórtice de 25 microlitros de grânulos CD4 por 30 segundos. Em seguida, transfira as esferas para um tubo de reação de 1,5 mililitro, contendo 1 mililitro de tampão MACS, e coloque o tubo em um ímã.

Após 1 minuto, use uma pipeta de 200 microlitros para aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os grânulos em 25 microlitros de tampão MACS. Em seguida, gire as células Vδ1-positivas isoladas e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão MACS. Misture as células vigorosamente com as contas. Então, após 20 minutos a 4 graus Celsius, com inclinação constante, coloque o tubo de volta no ímã.

Para evitar a perda de qualquer volume de amostra e minimizar a presença de células CD4 negativas contaminantes, é essencial pipetar qualquer tampão remanescente do interior da tampa de volta para o frasco.

Após dois minutos, use uma pipeta de 200 microlitros para transferir o sobrenadante contendo células Vδ1 positivas para CD4 para um novo tubo. Em seguida, remova as células CD4-positivas do ímã e ressuspenda-as em 500 microlitros de tampão MACS.

Depois de remover as células CD4-negativas mais duas vezes, como acabamos de demonstrar, incube as células CD4-positivas em 100 microlitros de meio de cultura e 10 microlitros de solução descoladora de esferas em temperatura ambiente por 45 minutos com inclinação constante. No final da incubação, retorne as células ao ímã por 1 minuto e use uma pipeta de 200 microlitros para transferir o sobrenadante contendo células positivas para Vδ1-positivo para V4 sem esferas para um novo tubo.

Depois de remover as contas restantes mais duas vezes, como acabamos de demonstrar, gire as células. Em seguida, ressuspenda as células CD4-positivas positivas para Vδ1 em meio fresco e pré-aquecido para contagem.