Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, são estruturas semelhantes a teias de fibras de cromatina complexadas com proteínas antimicrobianas que prendem e neutralizam patógenos. Os TNEs são secretados por neutrófilos - células imunes que armazenam proteínas antimicrobianas em grânulos citoplasmáticos especializados.

Para estudar a formação de TNE in vitro, tome uma suspensão de neutrófilos isolados. Adicione acetato de miristato de forbol, ou PMA - um composto pró-inflamatório lipofílico. Coloque as células em placas e incuba.

O PMA atravessa a membrana dos neutrófilos e entra no citoplasma, onde se liga e ativa a proteína quinase C ou PKC.

A PKC ativada induz a sinalização a jusante para fosforilar componentes citoplasmáticos da NADPH oxidase - um complexo enzimático - causando sua montagem no plasma e na membrana granular. O complexo produz espécies reativas de oxigênio ou ROS.

As ROS causam a liberação de proteases e proteínas antimicrobianas dos grânulos. Proteases granulares, juntamente com enzimas de citrulinação ativadas por ROS, translocam para o núcleo.

As proteases granulares causam degradação parcial das histonas, enquanto as enzimas de citrulinação promovem a citrulinação das histonas - neutralizando as cargas positivas. Essas modificações interrompem as interações histona-DNA, resultando na descondensação da cromatina.

A modificação da lâmina nuclear causa ruptura do envelope nuclear e exteriorização da cromatina; a cromatina se mistura com as proteínas antimicrobianas citoplasmáticas, formando NETs. A permeabilização da membrana celular causa a liberação extracelular de NETs.

Descarte o meio sem perturbar os TNEs e neutrófilos aderidos na parte inferior. Ressuspenda os componentes aderidos em um buffer.

Centrifugue para precipitar as células - deixando um sobrenadante rico em NET pronto para ensaios a jusante.

Para estimular a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, adicione 500 nanomolares de PMA a 30 mililitros da suspensão de neutrófilos em uma placa plana de cultura de tecidos de 150 milímetros por 25 milímetros com uma grade de 20 milímetros. Incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, aspire suavemente e descarte o meio, tomando cuidado para não romper a camada de TNEs e neutrófilos aderidos ao fundo do prato. Em seguida, use uma pipeta para lavar o fundo de cada prato com 15 mililitros de PBS frio sem cálcio e magnésio. Todo o material aderente deve ser removido do fundo.

Recolher a suspensão de lavagem num tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 450 x g durante 10 minutos a 4 graus Celsius. Os neutrófilos e quaisquer células restantes serão pellets na parte inferior, deixando um sobrenadante rico em NET e sem células.

Em seguida, decantar o sobrenadante em vários tubos de 1,5 mililitro e centrifugar a 18.000 x g por 10 minutos a 4 graus Celsius para pellet o DNA. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS de modo que a concentração corresponda a 2 x^10,7 neutrófilos por 100 microlitros de PBS. Esse estoque NET livre de células pode ser usado para experimentos subsequentes.