Isolamento da Rede de Células Imunes Gengivais de Blocos de Dentes Murinos

A gengiva, ou tecido gengival, envolve a porção cervical dos dentes e o maxilar.

O tecido gengival compreende uma camada epitélio, separada do tecido conjuntivo subjacente por uma membrana basal rica em colágeno IV. O tecido conjuntivo gengival contém uma rede de células imunes, incluindo linfócitos, mastócitos e neutrófilos que protegem a gengiva de infecções.

Para isolar a rede de células imunes gengivais, pegue blocos de dentes murinos contendo tecido gengival firmemente aderido. Trate os blocos com um coquetel enzimático - contendo colagenases tipo quatro e DNases.

As colagenases entram no tecido, degradam o colágeno-IV e rompem a membrana basal e o epitélio gengival, fazendo com que a gengiva se solte dos dentes. Enquanto isso, as DNases degradam os contaminantes do DNA. Adicione um agente quelante ao tubo; para remover cátions divalentes e evitar a agregação celular.

Transfira os blocos de dentes digeridos para uma placa de Petri contendo meio DNase. Extraia o tecido gengival dos blocos de dentes e transfira-o para um filtro de células.

Usando um êmbolo, amasse o tecido. Essa dissociação mecânica rompe a camada conjuntiva gengival, liberando as células imunes do tecido. Lave o filtro com meio e recolha as células libertadas no filtrado.

Centrifugue o filtrado, peletizando as células, e descarte o sobrenadante contendo enzimas residuais e detritos. Ressuspenda a população de células que transportam células imunes em meios completos, prontos para análise futura.

Elimine o excesso de tecido da borda da gengiva e transfira os blocos maxilar e mandibular para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 mililitros de colagenase e DNase no gelo. Digerir o tecido em uma incubadora agitadora a 37 graus Celsius por 1 hora, adicionando 50 microlitros de EDTA 0,5 molar durante os últimos cinco minutos. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio DNase frio aos tecidos e misture suavemente o conteúdo do tubo girando. Em seguida, transfira os quatro blocos de tecido para uma placa de Petri e cubra-os com 500 microlitros de meio DNase fresco.

Use um bisturi para remover a gengiva de cada bloco de tecido e transfira todo o conteúdo do prato para um filtro de células de 70 mícrons em cima de um tubo de 50 mililitros. Lave a placa de Petri e o filtro com 3 a 5 mililitros de meio DNase fresco e, em seguida, use o êmbolo de uma seringa estéril de 3 mililitros para esmagar o tecido gengival contra a malha do filtro. Enxágue o filtro com 30 a 35 mililitros de meio DNase frio e centrifugue o filtrado. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo e determine o número de células viáveis.