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Armadilhas extracelulares de macrófagos, METs, são estruturas semelhantes a teias liberadas por macrófagos para capturar e eliminar patógenos.
Os METs compreendem fibras de cromatina extracelular associadas à metaloproteinase-9 da matriz, MMP-9 e histona citrulinada H3, H3Cit - uma proteína histona modificada na qual a arginina é convertida em citrulina.
Para caracterizar METs em cortes de tecido pulmonar murino fixados em formalina e embebidos em parafina, primeiro seque as lâminas. Mergulhe em xileno para desparafinizar as seções. Use etanol aquoso para reidratar as seções.
Aqueça as seções para quebrar as ligações cruzadas de proteínas induzidas por formalina, expondo os antígenos alvo para subsequente ligação de anticorpos.
Adicione uma solução contendo proteína para bloquear locais de ligação não específicos. Incube com um coquetel de anticorpos primários anti-MMP-9, anti-H3Cit e anti-F4/80.
O anticorpo anti-F4/80 liga-se à glicoproteína F4/80 da superfície celular dos macrófagos. Os anticorpos anti-MMP-9 e anti-H3Cit ligam-se ao MMP-9 e H3Cit em METs, respectivamente. Adicione diferentes anticorpos secundários conjugados com fluoróforos que se ligam aos seus respectivos anticorpos primários ligados aos seus alvos.
Monte as seções com suporte de montagem contendo DAPI. O DAPI cora as fibras de cromatina dos METs. Usando um microscópio confocal, obtenha imagens das seções para visualizar a fluorescência dos marcadores MET.
Os METs são caracterizados por suas fibras de cromatina extracelular e pela co-expressão de F4/80, MMP-9 e H3Cit.
Para pré-tratar as amostras FFPE com solução de recuperação de antígeno, seque as lâminas no forno a 60 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, transfira as lâminas para solução de xileno por 30 minutos, antes de transferir as amostras para etanol a 70% em temperatura ambiente por 5 minutos.
Depois de usar água da torneira para enxaguar as lâminas, coloque-as em filme plástico à prova de calor e submeta-as a uma maior recuperação de antígeno, colocando-as em uma panela de pressão em Tris-EDTA pH 9.0 por 10 minutos. Resfrie as amostras por 20 minutos e transfira-as para água da torneira. Em seguida, coloque-os em uma cadeira de balanço por 5 minutos. Repita a lavagem com água da torneira e, em seguida, lave os slides uma vez em PBS no balancim.
Para bloquear as amostras, adicione 10% de soro de frango em 5% de BSA/PBS e incube-as em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, para definir armadilhas extracelulares de macrófagos, ou METs em macrófagos, adicione uma diluição de 1 a 100 de anticorpos primários em 1% BSA/PBS e incube as lâminas a 4 graus Celsius por 16 horas.
Use PBS para lavar as amostras duas vezes em um balancim por 5 minutos cada. Adicione os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes em BSA/PBS a 1% e incube as lâminas à temperatura ambiente durante 40 minutos. Após as lavagens de PBS, use meio de montagem contendo DAPI para manchar a cromatina e montar as amostras.
Usando um cabeçote confocal de varredura a laser conectado a um microscópio invertido, capture imagens fluorescentes usando objetivas de ar 20X 0,1 NA e 40X 1,0 NA óleo. Capture imagens de plano único de 512 por 512 pixels clicando no botão de nivelamento sequencial de linha. Obtenha pelo menos 10 campos de visão por seção para análise e dados para cada resultado.