Visualização intravital de linfócitos intraepiteliais gama delta

Os linfócitos intraepiteliais gama delta, γδ IELs, são células T migratórias especializadas que expressam receptores de células T gama delta. Essas células são predominantemente encontradas no epitélio intestinal e patrulham o epitélio para limitar a translocação do patógeno pelo intestino.

Para visualizar γδ IELs dentro de um organismo vivo, comece com um camundongo transgênico anestesiado com o intestino delgado parcialmente exposto. O camundongo transgênico é geneticamente modificado para expressar proteínas repórter - proteínas fluorescentes verdes aprimoradas - exclusivamente em IELs γδ, permitindo seu rastreamento.

Usando um eletrocautério, crie uma linha de perfuração sobre o intestino delgado exposto ao longo da superfície antimesentérica, evitando sangramento excessivo.

Faça uma incisão longitudinal sobre a linha de perfuração para expor a mucosa intestinal, mostrando várias projeções semelhantes a dedos - vilosidades. Cada vilosidade contém células epiteliais com IELs γδ residentes que se projetam para o lúmen intestinal.

Posicione o mouse com a superfície mucosa exposta diretamente em contato com o corante fluorescente, conferindo fluorescência vermelha ao lúmen.

Imagem do mouse sob um microscópio confocal. Localize uma vilosidade e uma imagem em diferentes planos focais ao longo do eixo z, começando pelo epitélio da ponta da vilosidade. Combine essas seções ópticas para produzir uma imagem 3D.

A imagem intravital mostra o movimento dinâmico de IELs γδ de fluorescência verde ao longo da membrana basal da célula epitelial perto do lúmen vermelho.

Colocando dois pares de pinças de cada lado do mesentério subjacente entre os vasos sanguíneos, esfregue suavemente as pontas das pinças para criar um orifício na membrana. Usando uma pinça angular e uma agulha curva de ponta cônica presa a uma sutura de 5 centímetros, penetre em um lado do peritônio através do orifício na membrana e suba pelo outro lado do revestimento peritoneal, colocando uma sutura na parte superior e outra perto da parte inferior da incisão para fechar a incisão, mantendo a alça do intestino exteriorizada.

Para aumentar a probabilidade de sucesso, não amarre ou rasgue nenhum vaso sanguíneo ao colocar a estrutura abdominal e limite qualquer manuseio estranho do intestino.

Em seguida, feche a pele abaixo da alça intestinal da mesma maneira, colocando uma sutura no meio da incisão entre as suturas anteriores no peritônio subjacente. Usando um eletrocautério, faça uma linha de perfuração ao longo da borda antimesentérica e aplique imediatamente algumas gotas de água na superfície do intestino para evitar danos adicionais aos tecidos induzidos pelo calor.

Seque com um Kimwipe para remover a água residual. Use uma tesoura Vannas para cortar uma fenda horizontal de aproximadamente 1,5 centímetro na borda distal do tecido cauterizado, ao longo do comprimento da linha cauterizada em direção à extremidade proximal do segmento de tecido exteriorizado. Quando a superfície mucosa estiver exposta, cubra o abdômen com um Kimwipe úmido para manter o tecido hidratado.

Para imagens de microscopia confocal de disco giratório, transporte o mouse para o microscópio em um recipiente coberto. Inicie o software de imagem e incline a cabeça do microscópio para trás e adicione 150 microlitros de corante AlexaFluor de 1 micromolar na solução salina tamponada de Hank no fundo da lamínula de vidro. Posicione o mouse de forma que a superfície da mucosa aberta entre em contato direto com a lamínula.

Coloque o mouse e o prato no estágio de imagem em uma incubadora pré-aquecida. Defina a intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser para não mais do que 10 a 15 miliwatts e 120 a 150 milissegundos, respectivamente, e ajuste a média do quadro para "2".

Ative a função de ganho de multiplicação de elétrons para reduzir o ruído de fundo e selecione a calibração objetiva de 63X para garantir uma medição correta do tamanho do pixel. Usando o laser de 405 nanômetros e a objetiva de ar de 20x, visualize manualmente os núcleos para localizar um campo de vilosidades que não possui movimento perceptível ou desvio, evitando áreas de movimento artificial devido à respiração, peristaltismo ou batimentos cardíacos.

Usando a varredura XY, registre a coordenada xy do campo de interesse e mude para a objetiva 63X de imersão em glicerol. Adquira uma imagem ao vivo no canal de 405 nanômetros por até 1 minuto para confirmar que as vilosidades no campo selecionado estão estáveis, enquanto ajusta o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta das vilosidades.

Em seguida, adquira pilhas Z começando logo abaixo do epitélio da ponta das vilosidades, cerca de 15 a 20 micrômetros, até as vilosidades, até que seja difícil resolver os núcleos usando etapas de 1,5 micrômetro. 3 a 5 minutos após o início da aquisição, confirme a estabilidade da imagem e a motilidade intraepitelial das células gama-delta e continue adquirindo imagens por 30 a 60 minutos para cada campo de vilosidades.