Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:50 min. • July 8th, 2025
As micropartículas celulares são vesículas ligadas à membrana de tamanho submicrométrico que envolvem biomoléculas liberadas da membrana plasmática de células eucarióticas submetidas à apoptose.
Para gerar micropartículas derivadas de linfócitos T, LMPs in vitro, pegue um frasco de cultura contendo cultura de linfócitos T. Adicione actinomicina-D, um antibiótico. Incubar por um período apropriado.
A actinomicina-D entra nos linfócitos e se transloca para o núcleo. Ele intercala entre pares de bases de DNA específicos, inibindo a transcrição. Isso leva à parada do ciclo celular e ativa a via apoptótica.
No início da apoptose, a caspase-3 ativada cliva e ativa a quinase associada a rho, ROCK1. O ROCK1, por sua vez, fosforila suas proteínas-alvo a jusante, causando a contração da actomiosina, levando ao sangramento da membrana e à subsequente liberação de LMPs contendo os componentes citosólicos e nucleares no meio.
As células eventualmente sofrem apoptose.
Após a incubação, transferir o meio de cultura para um tubo fresco. Centrifugue para pellet os linfócitos T. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
Centrifugue para remover detritos de células grandes. Transfira o sobrenadante contendo LMPs para um frasco. Realize ultracentrifugação de alta velocidade para granular os LMPs. Ressuspenda os LMPs em um buffer. Armazene em baixas temperaturas até uma análise mais aprofundada.
Para começar, cultive células T CEM em quatro frascos T175, cada um contendo 150 mililitros de meio fresco, e incube a 37 graus Celsius a uma densidade de 2 milhões de células por mililitro.
Coletar as células de cada frasco por centrifugação a 200 vezes g por 5 minutos e ressuspender 300 vezes 10 às 6 células em um novo frasco T175 contendo 150 mililitros de meio fresco, para manter a densidade de 2 milhões de células por mililitro. Adicione 37,5 microlitros de actinomicina D ao meio a uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro e incube a 37 graus Celsius por 24 horas.
Transfira todo o meio de cultura para tubos cônicos de 50 mililitros e gire as células a 750 vezes g por 5 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue a 1.500 vezes g por 15 minutos para remover fragmentos de células grandes.
Em seguida, transfira o sobrenadante para um frasco de 250 mililitros e ultracentrifugue a 12.000 vezes g por 50 minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante e colete os pellets. Use 40 mililitros de PBS estéril para lavar os pellets enriquecidos com LMP em um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 12.000 vezes g por 50 minutos. Repita esta etapa duas vezes.
Recolha o sobrenadante da última lavagem para ser utilizado como comando do veículo, com 1 mililitro de PBS. Suspenda os pellets e transfira para um microtubo estéril de 1,5 mililitro. Alíquota e armazene LMPs isolados a 80 graus Celsius negativos.