Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

O fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, GM-CSF, é secretado por células T auxiliares ou T_HGM produtoras de GM-CSF. Essas células mostram uma baixa expressão de outras citocinas específicas de células T auxiliares.

Para iniciar a diferenciação in vitro de células T_HGM, tome uma suspensão de células T auxiliares - isoladas do baço de camundongo - contendo células maduras ativadas por antígeno e células virgens indiferenciadas.

Adicione anticorpos marcados com fluorescência direcionados a marcadores de superfície característicos das células virgens e maduras. Execute a classificação de células ativadas por fluorescência para isolar as células T virgens.

Coloque as células em um poço revestido com anticorpos que se ligam ao complexo receptor de células T. Adicione um anticorpo que se liga ao receptor co-estimulatório. A ligação sinérgica ativa as células.

Adicione a interleucina 7 - uma citocina - induzindo a diferenciação em células T_HGM e a produção de GM-CSF. Adicione acetato de miristato de forbol, PMA - um composto pró-inflamatório, ionomicina - um ionóforo de cálcio e um inibidor de transporte de proteínas.

O PMA entra na célula e ativa uma proteína quinase. A ionomicina permeável à membrana transloca os íons de cálcio dentro da célula - aumentando a concentração de cálcio intracelular.

A ativação da proteína quinase e um alto nível de cálcio iniciam sinais que reestimulam as células T_HGM - resultando em maior produção de GM-CSF. O inibidor de transporte de proteínas bloqueia a secreção de GM-CSF, auxiliando na detecção intracelular.

Realize a coloração por imunofluorescência, detectando citocinas intracelulares e analisando as células usando citometria de fluxo. A maioria das células que apresentam altos níveis de GM-CSF, mas uma baixa expressão de outras citocinas, indica uma diferenciação bem-sucedida em células T_HGM.

Para isolar as células T CD4-positivas, ressuspenda o grânulo branco em 5 mililitros de tampão de isolamento celular e filtre a suspensão celular através de um filtro de 30 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros para remover quaisquer detritos. Após a contagem, ressuspenda as células em 1 x 10⁷ células por 90 microlitros de concentração de tampão e adicione 10 microlitros de esferas magnéticas conjugadas anti-CD4 por 1 x 10⁷ células para uma incubação de 15 minutos a 4 graus Celsius, com mistura a cada 5 minutos.

Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna de separação em um suporte magnético e pré-umedeça a coluna com 2 mililitros de tampão. Em seguida, lave as células com 5 mililitros de tampão e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão. Carregar a amostra na coluna e recolher a fracção CD4-negativa num tubo cónico de 15 mililitros.

Quando todas as células tiverem passado pela coluna, lave o reservatório três vezes com 1 mililitro de tampão por lavagem antes de secar. Após a última lavagem, transfira a coluna para um novo tubo cônico de 15 mililitros e mergulhe a coluna com 2 mililitros de tampão de isolamento celular para expelir a fração positiva do grânulo. Em seguida, colete as células CD4-positivas por centrifugação.

Para a classificação celular ativada por fluorescência das células T virgens, ressuspenda o grânulo de células CD4-positivas classificadas por esferas em 500 microlitros de tampão e misture as células com um coquetel de anticorpos conjugados com fluorescência apropriado. Após 20 a 30 minutos no gelo, protegido da luz, lave as células em 5 mililitros de tampão fresco e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão fresco.

Filtre as células através de uma malha de náilon e transfira as células para um tubo FACS pré-codificado com 500 microlitros de tampão. Gate para selecionar as populações de células altas de ligantes CD4-positivo, CD25-negativo e CD44 baixo CD62. Em seguida, classifique as frações de células T CD4-positivas, CD25-negativas, CD-44 baixas, CD-62 ligantes em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e peletize as células T CD4-positivas virgens isoladas por centrifugação.

Para o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, ou GM-CSF, diferenciação de células T auxiliares, ressuspenda as células T classificadas em uma concentração de 1 x 10⁶ células por mililitro em meio RPMI completo contendo 50 beta-mercaptoetanol micromolar e aspire o anticorpo épsilon anti-CD3 de cada poço de uma placa pré-codificada de 48 poços.

Em seguida, semeie 2,5 x 10⁵ células em cada poço junto com IL-7, anti-CD28 e anti-IFN gama, e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por três dias. No terceiro dia de cultura, use um microscópio para verificar a diferenciação celular e colha as células para centrifugação.

Ressuspenda o pellet em meio RPMI completo fresco por duas lavagens, ressuspendendo as células em 1 mililitro de meio completo fresco após a segunda lavagem para contagem. Divida as células em três volumes iguais e estimule novamente a primeira alíquota de células com PMA e ionomicina na presença de um inibidor do transporte de proteínas por 4 a 6 horas.

No final da estimulação, colha as células para coloração com anticorpo anti-CD4. Após 30 minutos, fixe as células com 200 microlitros de tampão de fixação por 20 a 60 minutos, seguido de duas lavagens em 1 mililitro de tampão de permeabilização por lavagem. Em seguida, core para expressão de citocinas intracelulares por 30 minutos no escuro.