JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:29 min • July 8th, 2025
Para monitorar o recrutamento de neutrófilos - células imunes essenciais que facilitam a depuração bacteriana, comece com um camundongo anestesiado, transgênico e imunocomprometido com uma ferida expondo o tecido conjuntivo nas costas.
Os neutrófilos do camundongo transgênico expressam uma proteína fluorescente verde aprimorada, o que facilita o rastreamento de neutrófilos. Além disso, sua capacidade prejudicada de matar bactérias torna o camundongo mais suscetível à infecção.
Pegue um inoculante bacteriano geneticamente modificado que possua características de emissão de luz de bioluminescência.
Injete o inóculo bacteriano no local ferido, garantindo sua entrega entre o tecido conjuntivo e a fáscia - uma camada de tecido fibroso abaixo do tecido conjuntivo. No local da injeção, as bactérias proliferam e colonizam, causando infecção tecidual.
Em resposta à infecção, as células imunes liberam quimiocinas - moléculas de sinalização química que atraem os neutrófilos. Os neutrófilos migram rapidamente por quimiotaxia - movimento induzido por produtos químicos e extravasam através dos vasos sanguíneos para o tecido nas proximidades da infecção bacteriana.
Imagem do camundongo para sinais de bioluminescência e fluorescência, representando a carga bacteriana e os neutrófilos recrutados, respectivamente.
Com o tempo, um aumento nos sinais de bioluminescência e fluorescência se correlaciona com o aumento da carga bacteriana e o recrutamento contínuo de neutrófilos no local da infecção.
Para a inoculação de Staph aureus, encha uma seringa de insulina de calibre 28 com 50 microlitros do inoculante bacteriano bioluminescente preparado e use um dedo para puxar a derme do animal ferido para o lado. Segurando a seringa quase paralela ao tecido, insira lentamente a seringa no tecido até sentir uma diminuição repentina da resistência, indicando perfuração da fáscia.
Com a agulha colocada no centro da ferida, libere lentamente todo o volume do inoculante. Confirme se o inoculante forma uma bolha no centro da ferida com vazamento ou dispersão mínima e remova a seringa lentamente do animal. Em seguida, retorne o animal à sua gaiola com calor e monitoramento, até a recuperação total.
Após ferimentos e infecções, e diariamente durante o experimento, coloque o camundongo anestesiado em um gerador de imagens bioluminescente e de fluorescência com a ferida o mais plana possível. No software do gerador de imagens, selecione Luminescência e Fotografia como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para 1 minuto em binning pequeno, F/stop 1 para Luminescência, F/stop 8 para Fotografia e Aberto para o filtro de Emissão. Em seguida, clique em Adquirir para gravar a imagem.
Para imagens de fluorescência in vivo, selecione Fluorescência e Fotografia como os modos de imagem. O tempo de exposição deve ser predefinido para 1 segundo em binning pequeno, F / stop 1 para fluorescência, F / stop 8 para fotografia e comprimentos de onda de excitação e emissão de 465 em 30 nanômetros e 520 em 20 nanômetros com alta intensidade de lâmpada, respectivamente. Em seguida, clique em Adquirir para gravar a imagem.
Após a obtenção dos dois conjuntos de imagens, retornar o animal à sua gaiola com monitoramento até a recuperação total.
Para análise de imagem, abra a imagem a ser quantificada em um programa de software de análise de imagem apropriado e coloque a região circular padrão de interesse em toda a área da ferida, incluindo a pele ao redor. Clique em Medir região de interesse e registre os valores do fluxo médio da ferida para permitir que o fluxo médio de cada sinal seja plotado em relação ao tempo.
Para medir a cicatrização da ferida, encaixe uma região circular de interesse sobre a borda da ferida e meça a área da ferida em centímetros ao quadrado para permitir a plotagem da mudança fracionária da linha de base em relação ao tempo.