Identificando inibidores de quinase que modulam a resposta do timócito a fortes sinais de TCR

Comece com células de timócitos de camundongos em uma placa de vários poços. Adicione esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. A um subconjunto de alvéolos, adicionar uma concentração adequada do inibidor da quinase de ensaio. Incubar.

Os anticorpos se ligam aos receptores CD3 e CD28 da superfície celular nos timócitos duplo-positivos e os ativam, causando regulação negativa dos receptores de células T, TCRs e ativação da proteína quinase citosólica.

Essas proteínas quinases ativam vias de sinalização a jusante, levando ao aumento da expressão de CD69 na superfície celular e à ativação da caspase-3 citosólica. A caspase-3 ativada cliva proteínas celulares essenciais - iniciando a apoptose dos timócitos.

Nas células tratadas com o inibidor de quinase, os inibidores bloqueiam as quinases citosólicas, modulando a expressão de CD69 e a ativação da caspase-3.

Pipeta em um coquetel de anticorpos marcado com fluoróforo que se liga aos co-receptores TCR, CD4 e CD8 dos timócitos e aos receptores CD69. Trate os timócitos com um tampão para fixá-los e permeabilizá-los.

Incube com um anticorpo anti-caspase-3 marcado com fluoróforo que se liga à caspase-3 citosólica. A