Identificando inibidores de quinase que modulam a resposta do timócito a fortes sinais de TCR

Comece com células de timócitos de camundongos em uma placa de vários poços. Adicione esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. A um subconjunto de alvéolos, adicionar uma concentração adequada do inibidor da quinase de ensaio. Incubar.

Os anticorpos se ligam aos receptores CD3 e CD28 da superfície celular nos timócitos duplo-positivos e os ativam, causando regulação negativa dos receptores de células T, TCRs e ativação da proteína quinase citosólica.

Essas proteínas quinases ativam vias de sinalização a jusante, levando ao aumento da expressão de CD69 na superfície celular e à ativação da caspase-3 citosólica. A caspase-3 ativada cliva proteínas celulares essenciais - iniciando a apoptose dos timócitos.

Nas células tratadas com o inibidor de quinase, os inibidores bloqueiam as quinases citosólicas, modulando a expressão de CD69 e a ativação da caspase-3.

Pipeta em um coquetel de anticorpos marcado com fluoróforo que se liga aos co-receptores TCR, CD4 e CD8 dos timócitos e aos receptores CD69. Trate os timócitos com um tampão para fixá-los e permeabilizá-los.

Incube com um anticorpo anti-caspase-3 marcado com fluoróforo que se liga à caspase-3 citosólica. Analisar os timócitos por citometria de fluxo.

Os timócitos duplo-positivos de controle expressam os marcadores fluorescentes de superfície celular CD4, CD8 e CD69 e a caspase-3 intracelular e apresentam regulação negativa do TCR. Em contraste, os timócitos tratados com inibidores exibem níveis mais baixos de CD69 fluorescente e caspase-3.

Para iniciar o tratamento de timócitos com inibidores de quinase, use uma pipeta multicanal para adicionar 40 microlitros por poço de timócitos a uma placa de pequeno volume. Coloque o prato no gelo. Em seguida, pipete uma parte de inibidores de quinase, DMSO e dexametasona e quatro partes do meio RPMI completo em uma placa de 96 poços.

Designe oito poços da placa de pequeno volume para controles não tratados, quatro poços para controles positivos tratados com dexametasona para morte celular, adicionando a dexametasona diluída na concentração de 5 micromolares e quatro poços para controles tratados com veículo, adicionando 0,5 microlitros do DMSO diluído. Em seguida, a partir dos poços correspondentes da placa inibidora, adicione 0,5 microlitros de cada inibidor diluído à placa de 96 poços.

Para iniciar a estimulação dos timócitos, primeiro certifique-se de que as esferas anti-CD3 e CD28 estejam ressuspensas uniformemente. Em seguida, lave 1 mililitro das contas com 2 mililitros do tampão PBS. Coloque o tubo em um suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante e aspire a solução. Em seguida, ressuspenda as contas em 1 mililitro do meio RPMI completo.

Adicione 10 microlitros por poço da suspensão de esferas a cada amostra tratada com inibidor, as quatro amostras tratadas com DMSO e quatro das 8 amostras não tratadas. Adicione 10 microlitros do RPMI completo aos quatro poços não tratados restantes.

Use um agitador orbital de microplacas para agitar suavemente a placa. Em seguida, incube os timócitos em ambiente de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 17 a 20 horas ou durante a noite.

Preparar uma lavadora de placa de fluxo laminar automatizada, primeiro, com 150 mililitros de solução de etanol-Tween, depois com água deionizada suplementada com 1% de Tween-20 e, finalmente, com tampão de lavagem FACS. No final da incubação, usando o sistema lavador de placas, lave a placa com o tampão de lavagem FACS usando um ciclo de lavagem nove vezes. Cada lavagem adiciona e remove 55 microlitros de tampão de lavagem por fluxo laminar, resultando em diluição exponencial dos reagentes nos poços.

Para corar antígenos de superfície, primeiro, dilua uma unidade de volume de anticorpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD69 em 100 unidades de volume do tampão de lavagem FACS. Em seguida, ressuspenda as células em 25 microlitros da mistura de anticorpos de coloração. Use um agitador orbital de microplacas para agitar suavemente a placa e, em seguida, deixe a placa no gelo por 30 minutos.

Para fixar as células, primeiro lave a placa com 55 microlitros de tampão de lavagem FACS usando nove vezes o ciclo de lavagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, adicione 50 microlitros do tampão de fixação e permeabilização a cada poço. Misture bem e incube o prato no gelo por 30 minutos. Após a incubação, prepare um tampão de perm/lavagem 1x diluindo 25 mililitros do estoque 10x fornecido em 225 mililitros de água ultrapura.

Prepare a lavadora de placas com 1x buffer e lave a placa com 55 microlitros do 1x buffer usando um ciclo de lavagem nove vezes conforme descrito anteriormente. Misture 1 mililitro do anticorpo anti-caspase-3 com 2 mililitros do permanente 1x e tampão de lavagem. Adicione 25 microlitros por poço da mistura às células fixas.

Use um agitador orbital de microplacas para agitar suavemente a placa. Deixe o prato no gelo por uma hora. No final da incubação, repita a etapa de lavagem, nove vezes com o permanente 1x e o tampão de lavagem. Em seguida, adicione 25 microlitros do tampão de lavagem FACS a todos os poços da placa, pipete para cima e para baixo algumas vezes para misturar a solução.

Por fim, transfira as amostras misturadas para tubos de microtitulação. Encha os tubos com o tampão de lavagem FACS até um volume total de 200 microlitros e prossiga para a análise de citometria de fluxo.