Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:05 min. • July 8th, 2025
Os macrófagos peritoneais, residentes na cavidade peritoneal, engolfam patógenos e secretam citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias para modular a resposta imune.
Para estudar in vivo a ativação de macrófagos peritoneais, comece restringindo o camundongo para minimizar seu movimento. Pegue uma mistura de lipopolissacarídeos - antígenos derivados de patógenos e imunoglobulinas intravenosas e injete-os por via intraperitoneal.
Após a injeção, os lipopolissacarídeos se ligam aos receptores de reconhecimento de padrões dos macrófagos, desencadeando uma resposta imune e liberando citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-12.
Em contraste, as imunoglobulinas interagem com os receptores Fc dos macrófagos, regulando negativamente a resposta imune suprimindo a produção de IL-12 e promovendo a liberação de citocinas anti-inflamatórias, incluindo IL-10. Essa co-estimulação por lipopolissacarídeos e imunoglobulinas ativa os macrófagos peritoneais em macrófagos anti-inflamatórios.
Prenda o camundongo sacrificado e faça uma incisão longitudinal ao longo da cavidade abdominal. Retraia a pele do músculo abdominal. Injete um tampão na cavidade peritoneal; agitar para desalojar as células da cavidade peritoneal.
Colete o fluido peritoneal contendo macrófagos ativados.
Cultive esses macrófagos ativados em um meio contendo moléculas co-estimulatórias - imunoglobulinas e lipopolissacarídeos para permitir a produção de citocinas. Colete o meio gasto e quantifique os níveis de citocinas usando um ensaio imunoenzimático.
Uma concentração de IL-10 mais alta do que a IL-12 confirma a ativação bem-sucedida de macrófagos anti-inflamatórios peritoneais.
Prepare uma seringa de 1 mililitro com a quantidade necessária de imunoglobulina intravenosa e LPS e coloque uma agulha de calibre 26. Para controles, use PBS mais LPS.
Segure o rato pela nuca enquanto prende os quartos traseiros e a cauda com uma mão. Mire no quadrante inferior direito do abdômen e insira a agulha em um ângulo de 30 a 40 graus com o chanfro para cima e insira-a cerca de 1,5 cm. Em seguida, injete o bolo alimentar. Depois de uma hora, colha macrófagos peritoneais após a eutanásia do camundongo.
Em um capuz estéril, prenda o camundongo sacrificado a uma placa de espuma com os membros espalhados e esterilize o abdômen com etanol a 70%. Em seguida, faça uma incisão rasa de 2 milímetros ao longo da linha média e retire a pele abdominal. Evite perfurar a parede peritoneal.
Em seguida, carregue totalmente uma seringa de 5 mililitros com PBS estéril a pH 7,4 e injete o camundongo usando uma agulha de calibre 25 ou 27 na parte superior da cavidade peritoneal de ambos os lados em direção à linha média com o chanfro da agulha para cima. Depois de puxar a agulha para fora, massageie o peritônio por 10 segundos para desalojar as células.
Agora, insira a agulha novamente na cavidade e colete cerca de 3,75 mililitros de fluido de lavagem. Transfira o fluido de lavagem para um tubo cônico de 15 mililitros no gelo. Repita a injeção, massagem e coleta de fluido de lavagem mais três vezes e agrupe todas as coleções no mesmo tubo.
Durante a coleta final, pode ser mais fácil retirar o fluido de lavagem do outro lado do mouse. Em seguida, gire as células e ressuspenda-as em 500 microlitros de meio de revestimento. Em seguida, conte os macrófagos viáveis e ressuspenda-os a 1 milhão por mililitro. Agora, coloque 100 microlitros de suspensão nos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, incube as células por uma hora.
Os macrófagos peritoneais irão aderir à placa. Em seguida, remova as células não aderentes e enxágue cada poço duas vezes com 200 microlitros de IMDM quente. Após cada lavagem, aguarde 10 segundos e incline lentamente a placa para acumular a solução de enxágue. Após as lavagens, adicione novamente 100 microlitros de meio de revestimento e coloque a placa na incubadora.
Para o ELISA, continue a incubar as células sem estimulação por 24 horas. Em seguida, colete e esclareça o meio condicionado para análise de citocinas.