JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 8:18 min • July 8th, 2025
Para estudar a imunidade induzida pela vacina, tome uma injeção cheia de uma vacina acelular contra coqueluche. A vacina contém proteínas antigênicas de uma bactéria causadora de doenças respiratórias - Bordetella pertussis e adjuvantes que estendem a exposição ao antígeno para uma resposta imune sustentada.
Injete a vacina por via intramuscular em um camundongo anestesiado.
Após a injeção, as células apresentadoras de antígenos residentes, APCs, capturam e processam as proteínas antigênicas em peptídeos, apresentando-as em sua superfície. Essas APCs então migram para os linfonodos próximos e interagem com as células T, iniciando sua ativação e diferenciação em células T efetoras.
Essas células T efetoras circulam e migram para vários órgãos, incluindo os pulmões, onde residem como células T de memória residentes ou células TRM, levando à imunização.
Após a imunização, administre por via intranasal uma cepa resistente a antibióticos de Bordetella pertussis viva. Essas bactérias entram no tecido pulmonar e ativam as células TRM. As células TRM ativadas secretam citocinas inflamatórias que recrutam as células imunes para causar a depuração bacteriana.
Colha o tecido pulmonar do camundongo e homogeneize-o para obter uma suspensão unicelular. Espalhe a suspensão celular diluída em uma placa de ágar contendo antibiótico e incube-a para permitir a formação de colônias bacterianas.
O extrato de tecido de um camundongo imunizado exibe menos colônias em comparação com o de um camundongo não imunizado, confirmando a imunidade induzida pela vacina contra Bordetella pertussis.
Para a imunização, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo anestesiado de 6 a 12 semanas de idade e carregue uma seringa de insulina de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 28,5 com 0,1 mililitro da vacina de interesse. Segurando a seringa em um ângulo de 45 graus com o chanfro voltado para cima, insira a agulha aproximadamente 5 milímetros no deltóide do camundongo e injete a vacina.
Mantenha a agulha inserida no músculo por 5 a 10 segundos. Em seguida, gire a seringa 180 graus para que o chanfro fique voltado para baixo para criar uma vedação e evitar vazamento de vacina antes de retrair lentamente a agulha do local da injeção. Em seguida, retorne o mouse à sua gaiola com monitoramento até a recuperação total.
Cerca de duas semanas após o reforço, infecte camundongos imunizados. Segure um camundongo anestesiado pela nuca do tórax dorsal atrás das omoplatas e pescoço e posicione o mouse na posição vertical para acessar o nariz. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, aplique lentamente 20 a 25 microlitros do inóculo bacteriano de interesse em cada camada do animal, segurando o camundongo até que todo o inóculo tenha sido inalado. Em seguida, entregue um volume igual de PBS estéril a um grupo de camundongos como controle negativo.
No ponto final experimental apropriado, coloque um lado ventral de camundongo infectado para cima em uma placa de dissecação e prenda os membros. Molhe o corpo com etanol 70% e use uma pinça para prender a pele abaixo do abdômen no centro da pelve. Usando uma tesoura afiada, faça um corte vertical até a mandíbula e disseque a pele da parede peritoneal. Mova a pele para os lados da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéreis e segure o peritônio intacto abaixo da caixa torácica no fígado ou próximo a ele. Corte o peritônio em direção à caixa torácica para expor o trato digestivo inferior e mova o cólon para a esquerda para revelar o baço.
Usando uma pinça curva, segure o baço e disseque o tecido conjuntivo com uma tesoura. Em seguida, coloque o baço em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 3 mililitros de RPMI e 5% de soro fetal bovino no gelo. Use uma pinça para estabilizar a caixa torácica no processo xifóide e abra o diafragma. Os pulmões devem esvaziar e cair em direção à coluna.
Abra a caixa torácica nas laterais para remover o peitoral e corte as artérias e veias pulmonares para isolar e remover o lobo superior do pulmão direito. Fixe o lóbulo em um tubo cônico de 15 mililitros de formalina tamponada a 10% neutro à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas e isole os lobos restantes dos pulmões direito e esquerdo. Em seguida, coloque os lóbulos em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 2 mililitros de caseína a 1% em PBS no gelo.
Use um PIPETMAN de 1 mililitro com ponta para coletar o sangue que preenche a cavidade torácica e transfira o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado no gelo. Remova as glândulas parótida, sublingual e submaxilar e os gânglios linfáticos que cobrem a traqueia e abra e remova as membranas protetoras que envolvem a traqueia. Usando pinças finas e tesouras, separe cuidadosamente a traqueia do esôfago e qualquer outro tecido conjuntivo da parte superior das clavículas até a parte inferior da mandíbula.
Use uma pinça para segurar a traqueia e corte a traqueia na parte superior da clavícula. Puxe a traqueia para baixo para maximizar a elasticidade e corte a traqueia na parte inferior da mandíbula logo acima da laringe, isolando cerca de 1 centímetro de tecido. Em seguida, coloque o órgão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado contendo 0,3 mililitros de caseína a 1% em PBS no gelo.
Agora, gire o mouse para ter acesso livre ao nariz e borrife a cabeça com etanol 70%. Manualmente, segure o animal diretamente atrás do crânio e use uma tesoura para cortar a carne macia do focinho, começando pela parte inferior do nariz e subindo. Remova o pelo, a pele e os bigodes ao redor do nariz e insira as pontas de uma tesoura curva nas narinas com as curvas apontadas para baixo.
Abra a passagem nasal em direção aos olhos, criando uma formação em forma de V. Em seguida, use uma pinça fina para coletar o septo nasal e o tecido mole dentro da formação e coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga pré-rotulado de 1,5 mililitro contendo 0,3 mililitros de caseína a 1% em PBS no gelo.
Para processar o tecido pulmonar, transfira todo o conteúdo do tubo de amostra pulmonar para um homogeneizador estéril de 15 mililitros e use um pilão para homogeneizar o tecido. Dissociar a amostra até que não restem grandes partículas de tecido e retornar a suspensão homogeneizada ao tubo original de 15 mililitros. Remover uma alíquota de 0,3 mililitros para o revestimento de unidades formadoras de colónias e recolher o resto do homogeneizado por centrifugação.
Alíquota de 0,5 mililitros do sobrenadante em tubos de microcentrífuga pré-marcados para armazenamento a 20 graus Celsius negativos até a análise da expressão de citocinas por ELISA. Em seguida, dilua em série alíquotas de 0,1 mililitros da suspensão pulmonar homogeneizada reservada em 0,9 mililitros de PBS estéril por diluição e use um espalhador triangular estéril para plaquear 0,1 mililitro de cada diluição empiricamente escolhida em placas pré-rotuladas com 10% de Bordet-Gengou mais estreptomicina.