Dinâmica de organelas em linfócitos B após ativação com grânulos revestidos de antígeno

Os receptores de células B, BCRs, nos linfócitos B, ligam-se aos antígenos, causando ativação celular. Isso leva à internalização do antígeno para processamento em fragmentos de peptídeos, que são carregados em moléculas de MHC de classe II para apresentação aos linfócitos T auxiliares para gerar uma resposta imune eficaz.

Para estudar a ativação de linfócitos B in vitro usando esferas revestidas de antígeno, primeiro obtenha esferas revestidas de antígeno. Esses grânulos são covalentemente revestidos com antígenos, ligantes específicos para BCRs; uma proteína não reativa bloqueia os locais das esferas não ligadas, impedindo a ligação inespecífica de linfócitos B.

Adicione as contas à suspensão de linfócitos B. Semeie a mistura em uma lamínula revestida de poli-L-lisina.

Os linfócitos B carregados negativamente se ligam à lamínula carregada positivamente, imobilizando as células. Além disso, os antígenos dos grânulos se ligam especificamente aos BCRs. A interação do BCR com o antígeno ativa os linfócitos B, formando uma junção apertada - uma sinapse imunológica.

A interação inicia vias de sinalização intracelular, resultando na reorganização do citoesqueleto de actina. Isso causa a disseminação da membrana celular seguida de contração, durante a qual o microcluster do antígeno BCR se concentra no centro da sinapse imunológica.

Com a remodelação da actina, o centrossomo - um centro organizador de microtúbulos - se reposiciona perto da sinapse. O reposicionamento recruta organelas como lisossomos e o aparelho de Golgi próximo à sinapse imune para extrair e apresentar antígenos.

Os grânulos revestidos com antígenos são preparados incubando ligantes específicos com grânulos de aminoácidos previamente tratados com glutaraldeído para ativar grupos amino. Ressuspenda os grânulos ativados em 100 microlitros de PBS e vórtice. Enquanto isso, prepare a solução de antígeno adicionando 100 microgramas por ml de ligante BCR em 150 microlitros de PBS.

Em seguida, adicione 50 microlitros de grânulos ativados à solução de antígeno e incube durante a noite a 4 graus Celsius. Lembre-se, use também um ligante não relacionado como controle negativo. Após a incubação, lave o cordão com PBS, aspire o sobrenadante e substitua por PBS. Repita três vezes. Em seguida, bloqueie os grupos amino livres ressuspendendo os grânulos em 500 microlitros de uma solução de BSA. Finalmente, ressuspenda os grânulos em 70 microlitros de PBS.

Para calcular a concentração final, você pode usar um hemocitômetro para contar as contas. Para a ativação das células B, use um tubo de 50 ml e ressuspenda as células a uma concentração de 1,5 milhão por ml em CLICK suplementado com 5% de soro fetal bovino. Em seguida, adicione 150.000 células B correspondentes a 100 microlitros da mistura célula-grânulo a uma lamínula revestida com poli-L-lisina e incube a 37 graus para os diferentes pontos de tempo.