Efeito do anticorpo anti-C-fms na osteoclastogênese em células da medula óssea de camundongos in vitro

A osteoclastogênese é o processo pelo qual os precursores dos osteoclastos se diferenciam e se fundem para formar osteoclastos multinucleados.

Para estudar o efeito do anticorpo anti-c-fms na osteoclastogênese in vitro, pegue uma placa de cultura contendo uma suspensão de células da medula óssea de camundongo. Adicione o fator estimulador de colônias de macrófagos, M-CSF.

Em cultura, o M-CSF se liga ao seu receptor específico, c-fms, em células precursoras mieloides, ativando vias de sinalização e causando diferenciação em macrófagos da medula óssea, BMMs, que representam precursores de osteoclastos e aderem à placa.

Remova as células não aderentes. Colha os BMMs e semeie-os em poços de placas de vários poços. Suplemento com M-CSF e ativador do receptor do ligante do fator nuclear kappa-Β, RANKL.

Adicione concentrações crescentes de anticorpos anti-c-fms aos poços.

No poço de controle, o M-CSF se liga aos receptores c-fms e ativa as vias de sinalização, estimulando a expressão do receptor RANK e promovendo a sobrevivência e proliferação do BMM. O RANKL se liga aos receptores RANK, desencadeando uma cascata de sinalização e causando a diferenciação e fusão do BMM em osteoclastos.

Em poços com concentrações mais altas de anticorpos, os anticorpos se ligam e bloqueiam efetivamente os receptores c-fms e interrompem a sinalização necessária para a diferenciação dos osteoclastos, inibindo assim a formação de osteoclastos.

Realize a coloração para identificar e quantificar as populações de osteoclastos e determinar a concentração efetiva de anticorpos para inibir a osteoclastogênese na formação de osteoclastos induzidos por RANKL.

Semeie 10 milhões de células por 10 mililitros em uma placa de cultura de 10 centímetros e adicione M-CSF às células. Incube a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 3 dias. Remova o meio após três dias e lave as células duas vezes, vigorosamente, com 10 mililitros de PBS para remover as células não aderentes.

Adicione 5 mililitros de temperatura ambiente 0,02% de tripsina-EDTA em PBS e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 5 minutos. Pipete completamente as células para separá-las. Observe a cultura ao microscópio para garantir que as células tenham sido destacadas e pareçam arredondadas e flutuando no meio.

Quando as células forem destacadas, inative a reação adicionando 5 mililitros de alfa-MEM. Recolher as células num tubo cónico de 50 mililitros e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lave com 5 mililitros de alfa-MEM e centrifugue novamente a 300 x g por 5 minutos. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de alfa-MEM.

Semeie 1 milhão de células por 10 mililitros em uma placa de cultura de 10 centímetros e adicione M-CSF. Incube a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 3 dias. Colha as células anexadas, que representam os BMMs como precursores de osteoclastos após 3 dias. Semeie BMMs a 50.000 células por 200 microlitros de alfa-MEM em uma placa de 96 poços, por poço.

Para cada poço, adicione os estímulos desejados e, em seguida, adicione M-CSF para uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro. Adicione anticorpo anti-c-fms a cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 4 dias, enquanto troca de mídia em dias alternados por 4 dias e, em seguida, prossiga com a coloração e os ensaios conforme descrito no manuscrito.