JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:52 min • July 8th, 2025
Tome Drosophila macho do tipo selvagem anestesiado e mutante Dicer-2 em uma placa de injeção sob um estereomicroscópio. Certifique-se de que as moscas estejam livres de qualquer bactéria simbiótica que suprima a replicação do vírus de RNA.
Inocular as moscas por via intratorácica com um nanoinjetor contendo uma suspensão de vírus de RNA de fita simples de sentido positivo.
O vírus entra na célula hospedeira por meio de endocitose mediada por receptor e se replica produzindo RNA intermediário de fita dupla. O receptor de reconhecimento de padrão do hospedeiro Dicer-2 processa o RNA viral de fita dupla em pequenos RNAs interferentes, siRNAs.
O siRNA se liga ao complexo silenciador induzido por RNA, RISC, onde sua fita complementar é removida. Os siRNAs carregados de RISC se ligam a outros RNAs virais por meio de emparelhamento de bases complementares, causando degradação do RNA viral e silenciamento de genes.
A interação Dicer-2 e RNA viral ativa cascatas de sinalização antiviral a jusante, produzindo proteínas antivirais. Essas proteínas antivirais interagem com os receptores de citocinas ligados à proteína Janus quinase, ou JAK, das células hospedeiras vizinhas, iniciando a dimerização do receptor e a fosforilação de JAK.
As JAKs ativadas fosforilam e ativam as proteínas STAT, um transdutor de sinal e ativador de transcrição. Os STATs ativados se translocam para o núcleo e se ligam a sequências específicas de DNA, iniciando a transcrição de genes de resposta antiviral.
Cultive as moscas por um período desejado.
A análise a jusante indica diminuição da taxa de sobrevivência e aumento da carga viral em moscas mutantes Dicer-2.
Para infecção viral, primeiro, use um estereomicroscópio e uma pinça fina para quebrar a ponta de uma agulha capilar de vidro no diâmetro apropriado para nano-injeção. Para montar o injetor, coloque o O-ring de vedação e um espaçador branco no êmbolo de metal do injetor com a grande covinha voltada para fora.
Use uma seringa equipada com uma agulha de calibre 30 para encher a agulha de vidro com óleo mineral e coloque a agulha através do colarinho. Coloque o anel de vedação maior ao redor da base do colar, a cerca de 1 milímetro da extremidade romba da agulha, e monte a agulha no êmbolo do injetor.
Prenda a agulha no êmbolo e pressione o botão vazio para estender o êmbolo do microinjetor até ouvir um sinal sonoro. Agora pressione Fill para retrair o êmbolo 5 milímetros e mergulhe a agulha em uma suspensão viral de 100 unidades formadoras de placa. Agite suavemente um ou pelo menos três frascos para injetáveis de 20 Drosophila macho sem Wolbachia na placa de injeção.
As moscas dotadas de machos são preferidas, pois a variação hormonal durante o acasalamento e a reprodução pode influenciar a leitura com as fêmeas.
Em seguida, injete no tórax de cada mosca 50,6 nanolitros de solução de vírus na região de cor ligeiramente mais clara entre a mesopleura e a tetrapleura e meça a carga de DCV pelo ensaio de efeito citopático e RT-PCR quantitativo de moscas terrestres, como acabamos de demonstrar. Após a injeção, transfira cuidadosamente as moscas para um frasco novo e coloque o frasco na posição horizontal para evitar que as moscas grudem no meio durante a recuperação da anestesia.
Este estudo investiga a resposta antiviral em Drosophila ao examinar o papel da proteína Dicer-2 no processamento de RNA viral. A pesquisa destaca os mecanismos de interferência de RNA e a resposta imune subsequente desencadeada por infecções virais.
A nano-injeção intratorácica precisa de vírus em Drosophila permite a investigação controlada das interações entre hospedeiro e vírus e da ativação de vias imunológicas inatas. Esta abordagem apoia a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para vias de resposta antiviral, orientando decisões iniciais de portfólio na pesquisa de doenças infecciosas. As saídas quantitativas deste modelo aumentam a confiança preditiva para estudos translacionais subsequentes.
Este método integra-se na interface entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica, conectando a investigação do alvo genético com saídas fenotípicas quantitativas.
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Última atualização: 29 agosto 2026