Coloração de hematoxilina e eosina para avaliar danos no cólon na colite induzida por DSS

O sulfato de dextrano sódico, ou DSS, induz colite - uma doença inflamatória intestinal - em que a ruptura da barreira epitelial intestinal leva à inflamação.

Para avaliar o dano tecidual, pegue o tecido do cólon fixo isolado de um modelo murino de colite induzida por DSS. Mergulhe o tecido em um meio de incorporação para facilitar o corte e congele rapidamente.

Usando um criomicrótomo, obtenha uma seção de tecido fino e colete-a em uma lâmina de vidro.

Mergulhe a lâmina em uma solução contendo corante de hematoxilina oxidado ligado ao mordente - um cátion metálico - conferindo uma carga positiva ao corante. O complexo corante-mordente se liga ao DNA carregado negativamente, manchando o núcleo de roxo-avermelhado.

Mergulhe o tecido em uma solução ácido-álcool diferenciadora, removendo o corante não especificamente ligado do citoplasma e da matriz extracelular. Enxágue o tecido em um agente azulado - um meio alcalino - conferindo uma cor azul aos núcleos, aumentando o contraste.

Mergulhe a lâmina em concentrações crescentes de álcool para desidratar o tecido, aumentando a penetração da contracoloração.

Mergulhe o tecido na contracoloração - solução ácida de eosina - conferindo cor rosa às proteínas citoplasmáticas básicas e à matriz extracelular. Lave a lâmina com álcool para remover o excesso de eosina. Mergulhe o tecido em xileno para torná-lo transparente - para um melhor exame microscópico.

Sob um microscópio, a seção do cólon mostra dano tecidual agravado, indicando colite induzida por DSS.

Para coloração de hematoxilina e eosina do tecido isolado do cólon, na manhã seguinte, mergulhe os pedaços de tecido em sacarose a 30% em PBS durante a noite em tubos individuais de 15 mililitros para crioproteção das amostras. No dia seguinte, incorpore os tecidos na temperatura ideal de corte ou composto OCT e resfrie os tecidos a menos 20 graus Celsius até que a OCT endureça.

Coloque os blocos OCT em um criostato e ajuste o mostrador de espessura para 12 micrômetros, em seguida, corte e colete seções congeladas de 12 micrômetros de espessura em lâminas de microscópio de vidro. Quando todos os tecidos tiverem sido seccionados, aqueça as lâminas a 65 graus Celsius em uma placa quente por 20 minutos e lave as seções aquecidas brevemente em água destilada antes de corar com solução de coloração de hematoxilina por 5 minutos.

Remova o excesso de solução de hematoxilina em água corrente da torneira por 5 minutos e diferencie as seções com ácido clorídrico a 0,5% em etanol por 30 segundos, seguido de um enxágue de 1 minuto em água corrente da torneira. Em seguida, lave as amostras por 1 minuto em PBS, seguido de outra lavagem de 5 minutos em água corrente da torneira.

No final da lavagem, submergir os tecidos numa série ascendente de etanol durante 10 segundos por imersão, seguido de contra-coloração em eosina durante 2 minutos. Para a desidratação das amostras, submergir as lâminas em etanol a 95% e 2 trocas de etanol a 100% por 5 minutos por imersão, seguido de limpeza com duas trocas de xileno em 5 minutos. Em seguida, marque o dano tecidual nos cólons proximal, médio e distal de cada grupo experimental.