Síntese de biofilme in vitro por Staphylococcus aureus

Os biofilmes bacterianos são estruturas tridimensionais que consistem em comunidades bacterianas embutidas em uma matriz extracelular autogerada, que escapam da resposta imune do hospedeiro.

Para a preparação de biofilme de Staphylococcus aureus in vitro, transfira uma suspensão de Staphylococcus aureus em crescimento ativo com a densidade celular desejada para os poços revestidos de poli-L-lisina de uma placa de vários poços.

Durante a incubação sob condições estáticas, o revestimento de poli-L-lisina carregado positivamente facilita as interações eletrostáticas com os glicopolímeros carregados negativamente, como os ácidos teicóicos, na superfície bacteriana, promovendo a fixação bacteriana.

Com as fontes de nutrientes disponíveis, o Staphylococcus aureus se divide e se acumula, formando microcolônias. Além disso, as bactérias secretam uma matriz extracelular composta por polissacarídeos, proteínas e DNA extracelular, que envolve as células e promove a coesão bacteriana e a adesão à superfície.

Com a divisão celular contínua e a secreção da matriz, o biofilme amadurece em uma estrutura tridimensional com distribuição eficiente de moléculas de sinalização para comunicação célula a célula.

Ao atingir um limite de densidade bacteriana, o Staphylococcus aureus secreta proteases e nucleases, degradando a matriz do biofilme e liberando alguns Staphylococcus aureus no meio. Remova o meio contendo bactérias planctônicas flutuantes.

Adicione suavemente um tampão para evitar a ruptura do biofilme. Remova o tampão contendo quaisquer bactérias não anexadas restantes.

O biofilme gerado está pronto para experimentos a jusante.

Comece obtendo colônias isoladas de Staphylococcus aureus de um estoque criopreservado usando uma técnica de placa de listras em uma placa de ágar rica em nutrientes, como ágar soja tríptica. Cubra os poços individuais de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de PLL diluído em água estéril e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Aspire a solução PLL assepticamente, usando um coletor de aspiração assistido por vácuo. Deixe os poços secarem durante a noite em temperatura ambiente.

Prepare uma cultura durante a noite inoculando uma colônia de S. aureus em MEM-alfa suplementado com 2% de glicose e incube-a a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas a 200 rotações por minuto. Dilua a cultura durante a noite transferindo 50 microlitros para 5 mililitros de MEM-alfa fresco suplementado com 2% de glicose. Em seguida, incube-o a 37 graus Celsius a 200 rotações por minuto até que a fase logarítmica intermediária seja alcançada. Use MEM-alfa para normalizar a cultura logarítmica média para uma DO de 0,1.

Transfira 150 microlitros de cultura normalizada para cada poço da placa de 96 poços tratada com PLL. Incube a placa em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas. Aspirar o sobrenadante para remover as células planctónicas. Lave delicadamente a biomassa restante com 150 microlitros de HBSS para remover as células soltas. Repita pelo menos duas vezes para remover todas as células planctônicas.