JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:23 min • July 8th, 2025
Para estimular os linfócitos via Haemophilus influenzae - uma bactéria patogênica, tome uma suspensão de células mononucleares isoladas do sangue periférico, ou PBMCs, incluindo linfócitos e células apresentadoras de antígenos ou APCs.
Adicione uma suspensão bacteriana e incube à temperatura fisiológica.
Os receptores de reconhecimento de padrões nas APCs se ligam a componentes específicos das células bacterianas, desencadeando a fagocitose. O fagossomo - contendo bactérias internalizadas - se funde com o lisossomo, causando degradação bacteriana e processamento em fragmentos de peptídeos.
O complexo principal de histocompatibilidade ou moléculas de MHC ligam-se aos fragmentos peptídicos e os apresentam na superfície celular como antígenos. Os linfócitos T se ligam ao antígeno apresentado por meio do receptor de células T.
Adicione anticorpos co-estimulatórios que se ligam a receptores de superfície específicos nos linfócitos T. A ligação sinérgica induz a sinalização a jusante, ativando a produção de citocinas de linfócitos T.
Adicione um composto bloqueador de Golgi - bloqueando o transporte de proteínas vesiculares do retículo endoplasmático para o Golgi - para inibir a secreção de citocinas dos linfócitos T, facilitando o acúmulo de citocinas intracelulares.
Adicione um fixador para preservar a morfologia celular e detergente para permeabilizar a membrana celular. Adicione um coquetel de anticorpos marcados com fluorescência, incluindo anticorpos que se ligam aos marcadores de superfície específicos de linfócitos T - marcando a superfície celular - e anticorpos específicos de citocinas que penetram dentro da célula para se ligar a citocinas intracelulares.
Realize citometria de fluxo para detectar células com fluorescência dupla - indicando a produção de citocinas por linfócitos T estimulados.
Divida a amostra de sangue periférico em alíquotas para controle e estimulação do antígeno. Adicione anticorpos co-estimulatórios a ambas as amostras, adicione o H. influenzae não tipável à amostra de antígeno e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1 hora.
Em seguida, adicione o agente bloqueador de Golgi Brefeldin A às amostras e incube-as por mais cinco horas. Após lisar os eritrócitos conforme demonstrado anteriormente, fixe os leucócitos usando 500 microlitros de paraformaldeído a 1% a 2% por 1 hora. Conte as células usando um hemocitômetro e, em seguida, permeabilize 1 milhão de células com 100 microlitros de saponina a 0,1% por 15 minutos.
Em seguida, incube as células com anticorpos marcados com fluorescência apropriados. Lave as células e analise-as usando um citômetro de fluxo. Determine a proporção de células que respondem ao antígeno bloqueando as populações de linfócitos relevantes. Realize coloração de fundo em células não estimuladas para todas as citocinas a serem analisadas.