Determinação da produção de ROS por neutrófilos após interação com biofilme opsonizado

As bactérias marcadas com opsoninas são reconhecidas por receptores específicos de neutrófilos, desencadeando fagocitose com liberação de espécies reativas de oxigênio, ou ROS, e degradação bacteriana.

Para quantificar a produção de ROS por neutrófilos in vitro, pegue uma placa de vários poços. O poço de teste contém um biofilme de Staphylococcus aureus compreendendo bactérias embebidas em filme de matriz extracelular. O poço de controle está sem o biofilme.

Incube o biofilme com soro humano, permitindo que as opsoninas séricas opsonizem o biofilme.

Aspire o soro. Lave com tampão, removendo opsoninas não ligadas. Adicione neutrófilos e luminol - um composto quimioluminescente aos poços. Centrifugue, aproximando os neutrófilos do biofilme.

Usando um leitor de placas, meça a luminescência ao longo do tempo.

No poço contendo biofilme, os neutrófilos se ligam às opsoninas do biofilme, causando ativação de neutrófilos e internalização bacteriana em fagossomos. Vias de sinalização específicas são ativadas, causando a montagem da NADPH oxidase nos fagossomos.

A NADPH oxidase catalisa a transferência de elétrons do NADPH para o oxigênio molecular, gerando ROS que degradam as bactérias. Além disso, a NADPH oxidase na membrana celular libera ROS extracelularmente.

Em resposta, as bactérias do biofilme produzem enzimas que neutralizam as ERO e liberam leucocidinas que formam poros nas membranas dos neutrófilos e causam lise, interrompendo a produção de EROs. O luminol reage com ROS, causando sua excitação, e emite luminescência após o relaxamento.

O poço de teste exibe níveis aumentados de ROS em comparação com o controle, indicando interações de biofilme opsonizado por neutrófilos.

Adicione 100 microlitros de soro humano normal a 20% diluído em HBSS, gota a gota, ao biofilme lavado e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para opsonizar o biofilme. Aspire a solução de soro e lave os biofilmes, gota a gota, com 150 microlitros de HBSS. Aspire o HBSS, deixando para trás poços com biofilmes opsonizados.

Adicione luminol aos neutrófilos ressuspensos em HBSS para perfazer uma concentração final de 5 micromolares de luminol. Esta solução está pronta para uso nos grupos A e C. Adicione neutrófilos misturados com luminol aos poços com biofilmes opsonizados.

Para o grupo D, preparar a solução de luminol 50 micromolares em HBSS num tubo separado, sem neutrófilos, e adicioná-la ao poço que contém o biofilme. Alíquota de 350 microlitros de neutrófilos misturados com luminol e adicione PMA a uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro à mistura.

Para o grupo B, adicione os neutrófilos desta mistura em poços sem biofilme. Isso serve como um controle positivo. Centrifugue a placa a 270 RCF por 30 segundos a 4 graus Celsius. Certifique-se de que o leitor de placas esteja ajustado para 37 graus Celsius, a luminescência e a cinética lidas por 60 minutos com intervalos de 3 minutos.

Coloque a placa no leitor de placas para medir a produção de ROS por neutrófilos por 60 minutos.