JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:12 min • July 8th, 2025
Para estudar o impacto dos antimicrobianos nos agregados bacterianos, faça a cultura de Pseudomonas aeruginosa em um meio de crescimento que promova a formação de agregados - simulando o crescimento durante a infecção.
As bactérias modificadas expressam uma proteína fluorescente para detecção de agregados sob um microscópio de fluorescência. Imagem em três dimensões para calcular o volume dos agregados, ou a biomassa bacteriana, e visualizar o aumento da biomassa ao longo do tempo, indicando o crescimento bacteriano.
Adicione colistina - um peptídeo antimicrobiano catiônico - em uma concentração subletal que mata bactérias suscetíveis enquanto seleciona as tolerantes a antibióticos.
A colistina se liga a lipopolissacarídeos carregados negativamente, ou LPS, na membrana externa bacteriana, deslocando pontes catiônicas que estabilizam a monocamada de LPS - danificando a integridade da membrana.
A colistina entra no periplasma e se liga ao LPS na membrana celular, rompendo a membrana e resultando em lise celular. Como mecanismo de contra-ataque, mutações genéticas específicas em um subconjunto de bactérias neutralizam a carga negativa do LPS. Essa modificação inibe a interação eletrostática da colistina catiônica com menos LPS aniônico - prevenindo a morte celular.
Imagem para visualizar a diminuição da biomassa com o tempo, indicando o impacto do antimicrobiano. Adicione iodeto de propídio ou PI - um corante fluorescente - que entra pela membrana danificada para se ligar ao DNA, rotulando apenas as células mortas.
Realize a classificação de células ativadas por fluorescência, ou FACS, separando células suscetíveis marcadas com IP e células tolerantes a antibióticos marcadas com fluorescência. As células estão prontas para ensaios a jusante.
Para obter imagens dos agregados de Pseudomonas aeruginosa por microscópio confocal de varredura a laser, no final da incubação, designe três poços da placa de cultura como replicações de tratamento com antibióticos em um poço como o "controle sem tratamento" e coloque a placa no estágio aquecido do microscópio.
Selecione uma objetiva de imersão em óleo 63 vezes e abra a guia Localizar para identificar os agregados bacterianos no campo claro. Defina uma área para geração de imagens dentro de cada poço e use o módulo Posições para armazenar a posição da área. Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 509 nanômetros.
No módulo Aquisição, selecione a opção Z-Stack para adquirir as imagens e use o módulo Line Averaging para reduzir a fluorescência de fundo no canal GFP dentro do volume total das imagens Z-stack. Defina a opção Série Temporal para capturar 60 fatias em cada poço em intervalos de 15 minutos por 18 horas e use a estratégia de foco definido para armazenar um plano focal para cada posição que será recriada em cada ponto de tempo ao longo do experimento.
4,5 horas após a configuração do experimento de imagem, crie imagens de cada posição para determinar a biomassa agregada dentro de cada um dos quatro poços antes da adição do antibiótico. Após seis horas, adicione suavemente antibiótico duas vezes abaixo da concentração inibitória mínima no meio de cada poço, logo abaixo da interface ar-líquido, e clique em Iniciar experimento para iniciar a imagem do tratamento pós-antibiótico.
Para isolar as células vivas, ao final do período de imagem de 18 horas, rotule as bactérias em cada poço com o volume apropriado de iodeto de propídio, de acordo com as recomendações do fabricante. No final da incubação, use um recipiente isolado para transferir a placa para o citômetro de fluxo e ajuste o citômetro para detectar GFP e iodeto de propídio usando um bico de 70 mícrons. Em seguida, execute alíquotas de 1 mililitro de cada sobrenadante de cultura na taxa de fluxo mais baixa para classificar os agregados viáveis de Pseudomonas aeruginosa positivos para GFP e não viáveis negativos para iodeto de propídio.