Quantificação da infecção bacteriana em células hospedeiras pelo ensaio da unidade formadora de colônias

Para iniciar o ensaio de unidade formadora de colônias, ou UFC, para quantificar bactérias viáveis, pegue uma placa de vários poços contendo macrófagos cultivados em meio de crescimento. Infecte os macrófagos com Listeria monocytogenes, uma bactéria patogênica capaz de crescimento intracelular.

Durante a infecção, os macrófagos engolfam as bactérias, internalizando as bactérias dentro de um compartimento ligado à membrana - um fagossomo.

As bactérias secretam uma toxina formadora de poros e rompem a membrana fagossômica. Assim, as bactérias podem entrar no citosol e se replicar dentro dos macrófagos.

Trate brevemente os macrófagos infectados com gentamicina, um antibiótico que elimina seletivamente bactérias não internalizadas, preservando as bactérias intracelulares.

Aspirar os meios sobrejacentes contendo antibióticos. Em seguida, adicione água destilada estéril sobre os macrófagos infectados, criando um ambiente hipotônico. Isso leva à osmose, onde as moléculas de água entram nas células e causam a lise dos macrófagos, liberando os componentes intracelulares, incluindo as bactérias.

Espalhe o lisado celular contendo bactérias intracelulares na placa de ágar lisogenia, promovendo a separação de células bacterianas individuais e permitindo seu crescimento independente. Durante a incubação, as bactérias viáveis crescem na superfície do ágar e formam colônias distintas.

Conte as colônias na placa e obtenha a UFC, representando bactérias intracelulares que escaparam da resposta imune do hospedeiro e se replicaram com sucesso dentro dos macrófagos infectados.

Para colher, incline levemente o prato e use cuidadosamente uma pipeta para remover todo o meio do poço. Adicione 0,5 mililitros de água estéril destilada ao poço. Após 30 segundos, transfira o lisado de água resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vore vigorosamente por 10 segundos.

Adicione 4,5 microlitros e 50 microlitros do lisado de água a 450 microlitros de água estéril destilada para preparar as diluições de 10 e 100 vezes. Resumidamente, vórtice para garantir uma mistura completa. Adicione 50 microlitros das amostras originais diluídas em 10 vezes e diluídas em 100 vezes em placas de ágar caldo de lisogenia e espalhe usando um espalhador de placas.

Para analisar o Lm emergente, extraia 10 microlitros do meio sobreposto do prato e divida-o em duas alíquotas de 5 microlitros em tubos de microcentrífuga. Adicione 5 microlitros de DMEM/FCS a uma alíquota e adicione 5 microlitros de DMEM/FCS contendo 5 microlitros por mililitro de gentamicina à segunda alíquota como controle.

Aguarde 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 90 microlitros de água estéril destilada a cada alíquota e vortex o tubo vigorosamente por 10 segundos. Em seguida, adicione 50 microlitros da amostra em placas de ágar LB e espalhe usando um espalhador de placas. Armazene as placas em incubadora de 37 graus Celsius por dois dias antes de enumerar as colônias Ml.