JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:21 min • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo uma cultura de macrófagos. Infectar com Listeria monocytogenes que expressam proteínas fluorescentes, Lm.
As proteínas em Lm se ligam a receptores específicos de macrófagos, internalizando as bactérias dentro de um fagossomo. Além disso, Lm secreta toxinas formadoras de poros que rompem a membrana do fagossomo, liberando bactérias no citosol, onde se replicam e ficam cercadas por filamentos de actina hospedeiros.
As proteínas ActA indutoras de actina em Lm induzem a polimerização contínua da actina na extremidade traseira da bactéria. A cauda do cometa de actina gerada impulsiona Lm através do citosol e penetra na membrana celular dos macrófagos, liberando Lm polimerizado envolto em actina no meio.
Após a incubação, coletar e fixar o meio extracelular, ligado à actina e contendo Lm de um conjunto de poços. Fixe o Lm usando paraformaldeído. Adicione água destilada, rompendo os macrófagos e liberando o Lm intracelular. Coletar o Lm intracelular e fixar a amostra com paraformaldeído.
Em outros poços, substitua o meio por meio contendo gentamicina impermeável às células para eliminar o Lm extracelular. Substitua por meio novo e incube pelo período desejado.
Após a incubação, recolher os meios extracelulares contendo Lm e fixar a amostra com paraformaldeído. Utilizar água destilada para obter lisado contendo Lm intracelular e fixar a amostra com paraformaldeído. Adicione faloidina marcada com fluorescência às amostras, que se liga seletivamente à actina polimerizada.
Usando um citômetro de fluxo, visualize sinais fluorescentes de Lm e faloidina de ligação à actina nas amostras. Quantifique o Lm ligado à actina extracelular e intracelular derivado dos macrófagos infectados.
Usando um contador de células automatizado, ajuste as células RAW 264.7 preparadas para a concentração de 1 x 106 células por mililitro. Adicione 1 mililitro da amostra aos poços de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Infectar as células com inóculo Lm preparado correspondente a uma multiplicidade de infecção de 50.
Às 1,5 horas após a infecção, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro preenchido com 500 microlitros de 4% de PFA, colete o meio do primeiro conjunto de poços e coloque o tubo no gelo. Para coletar Lm intracelular, adicione 1 mililitro de água estéril destilada a cada poço. Após 60 segundos, transfira o lisado de água resultante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 500 microlitros de 4% de PFA. Vortex o tubo vigorosamente por 10 segundos e coloque-o no gelo.
Para os poços restantes, remova o meio e substitua por 1 mililitro de DMEM/FCS por 5 microgramas por mililitro de gentamicina para matar Lm extracelular. Retorne imediatamente o prato à incubadora.
Após 30 minutos, remova a mídia e substitua por DMEM/FCS sem gentamicina. Depois de mais duas e quatro horas, colete mídia em lisados para o segundo e terceiro pontos de tempo nos tubos e coloque-os no gelo para esfriar. Tubos de centrífuga a 10.000 vezes g por 7 minutos.
Usando uma pipeta, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Adicione o coquetel de coloração contendo 50 microlitros de 4% de PFA e 15 microlitros de faloidina no tubo e misture para ressuspender cada pellet. Incube tubos no escuro a 4 graus Celsius por 20 minutos.
Após a incubação, adicione 1 mililitro de tampão FACS a cada tubo e pipete para cima e para baixo para misturar. Gire os tubos na centrífuga a 10.000 vezes g por 7 minutos. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.
Para uso imediato, suspenda cada pellet em 400 microlitros de tampão FACS. Se armazenar para análise posterior, adicione 200 microlitros de tampão FACS e 200 microlitros de PFA a 4% no tubo e misture para suspender.