Infectando moscas com suspensão bacteriana usando um nanoinjetor

Para infectar moscas, comece com uma agulha de vidro de diâmetro estreito cheia de óleo mineral.

Prenda a agulha no êmbolo do nanoinjetor com um O-ring e um espaçador para injeção precisa e controlada, garantindo danos mínimos às moscas.

Solte o óleo mineral, deixando uma pequena quantidade na agulha como barreira entre a solução bacteriana e o injetor. Carregue a agulha com a suspensão bacteriana.

Posicione uma Drosophila melanogaster anestesiada com o lado ventrolateral para cima.

Injete a agulha no abdômen anterior da mosca, perfurando a cutícula e a camada epitelial. Entregue a suspensão bacteriana na hemocele - uma cavidade corporal contendo hemolinfa - um fluido circulatório rico em nutrientes.

Dentro da hemocele, células imunes chamadas hemócitos circulam ao lado do corpo adiposo, um tecido especializado equipado com receptores de reconhecimento de padrões.

Deixar que as moscas injetadas recuperem num frasco para injetáveis contendo meio. As bactérias injetadas utilizam os nutrientes da hemolinfa e se multiplicam, aumentando a carga bacteriana e estabelecendo uma infecção sistêmica.

Os receptores das células do corpo adiposo interagem com antígenos bacterianos, desencadeando uma resposta imune para produzir peptídeos antimicrobianos, eliminando algumas bactérias.

Os hemócitos circulantes realizam atividade fagocítica, engolindo e degradando algumas bactérias. No entanto, algumas bactérias escapam da resposta imune do hospedeiro e sobrevivem dentro das moscas, estabelecendo uma infecção bacteriana.

Prepare uma agulha de vidro puxando um capilar de vidro de borossilicato e use uma pinça para quebrar a ponta da agulha para criar uma abertura de 50 micrômetros de diâmetro. Em seguida, coloque o O-ring de vedação e o espaçador branco, com a grande covinha voltada para fora, no êmbolo de metal do injetor. Encha a agulha de vidro com óleo mineral usando uma seringa com uma agulha de calibre 30.

Em seguida, coloque a agulha de vidro cheia através da pinça e coloque o O-ring maior ao redor de sua base, a 1 milímetro da extremidade cega da agulha. Deslize a agulha no êmbolo de metal e aperte suavemente a pinça até que esteja segura.

Dissipe o óleo mineral do injetor deixando um pequeno volume de óleo na agulha para atuar como uma barreira entre o injetor e a suspensão bacteriana. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro do óleo mineral, suspensão bacteriana ou entre os dois líquidos. Em seguida, ajuste o injetor para o volume desejado para injeção. Insira cuidadosamente a ponta da agulha capilar em um tubo de PBS estéril e pressione o botão de enchimento no injetor para encher a agulha do injetor.

Para gerar controles de ferimentos, injete moscas anestesiadas com PBS estéril no abdômen anterior na superfície ventrolateral. Coloque as moscas injetadas em frascos novos com novos meios e coloque-os de lado para evitar que as moscas fiquem presas aos alimentos antes de se recuperarem da anestesia. Em seguida, ejete o meio estéril restante do injetor e encha novamente a mesma agulha com a suspensão bacteriana. Repita o procedimento e injete as moscas com a suspensão bacteriana.