Detecção de ativação do inflamassoma por microscopia de fluorescência

Para detectar a ativação do inflamassoma do receptor P3 do tipo NOD, ou NLRP3, pegue uma placa de vários poços contendo macrófagos ativados que expressam proteínas NLRP3.

Trate as células com meios contendo ionóforos e glicina. Os ionóforos induzem o efluxo de íons potássio, ativando e oligomerizando as proteínas NLRP3. O NLRP3 oligomerizado recruta proteínas adaptadoras, facilitando a ligação da pró-caspase-1, formando o complexo inflamassoma NLRP3.

No inflamassoma, a proximidade desencadeia a autoclivagem pró-caspase-1, liberando caspases ativas, iniciando piroptose e condensação nuclear. Além disso, a glicina estabiliza a estrutura celular, impedindo a lise celular.

Trate macrófagos com sondas repórteres fluorescentes contendo um grupo de ligação caspase-1 e um fluoróforo ligado por meio de uma sequência de aminoácidos. A caspase-1 ativada reconhece a sequência de aminoácidos da sonda e se liga ao seu grupo de ligação à caspase, permitindo sua visualização.

Fixe as células e cubra-as com corante fluorescente para manchar os núcleos. Imagem sob um microscópio de fluorescência.

Conte macrófagos com núcleos condensados azuis e focos fluorescentes verdes de caspase-1 ativada, sugerindo ativação do inflamassoma NLRP3.

Comece substituindo o meio de macrófagos derivados da medula óssea preparados com LPS semeados em lamínulas de vidro por 290 microlitros de meio DMEM-5 suplementado com nigericina 5 micromolar e glicina 5 milimolar por poço. Retorne a placa de 24 poços para a incubadora de cultura de células por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, adicionando 10 microlitros de 30X FAM-YVAD-FMK após os primeiros 15 minutos.

No final da incubação, lave as células com 1 mililitro de PBS frio por poço três vezes por 5 minutos por lavagem, e fixe as células com 250 microlitros de paraformaldeído a 2% por poço por 30 minutos em gelo, protegido da luz, marcando as células com um corante nuclear fluorescente apropriado durante os últimos cinco minutos.

No final da incubação, lave as células três vezes com PBS frio, conforme demonstrado, e carregue cada lâmina com 7 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento. Coloque uma lamínula em cada lâmina e deixe o meio de montagem endurecer durante a noite antes de selar as lamínulas com esmalte.

Para obter imagens das células por microscopia confocal de fluorescência, coloque a lâmina de controle não tratada no estágio do microscópio e concentre-se manualmente nas células. Usando as configurações da tabela de pesquisa do microscópio, ajuste o deslocamento até que nenhuma sonda positiva seja observada nas células não tratadas.

Em seguida, usando uma amostra tratada com nigericina, localize um campo que contenha células positivas e negativas para a coloração da sonda e ajuste o plano de imagem do canal da sonda para o plano que tem a maior intensidade de coloração positiva. Em seguida, ajuste o ganho até que os focos sejam visíveis nas células com núcleos condensados e obtenha imagens de cinco campos selecionados aleatoriamente por lâmina com uma ampliação total de 100X.