Uma técnica in vitro para estudar a formação de complexos inflamassoma em macrófagos

Comece com uma placa contendo uma cultura de macrófagos primários.

Introduza lipopolissacarídeo bacteriano, LPS, que se liga a receptores toll-like em macrófagos, desencadeando a regulação positiva da proteína NLR contendo domínio de pirina 3 ou NLRP3.

Adicione um ionóforo que medeia o efluxo de íons de potássio. A diminuição do potássio citosólico ativa o NLRP3. O NLRP3 ativado oligomeriza e induz o recrutamento de uma proteína adaptadora, que por sua vez recruta pró-caspase-1, formando um inflamassoma.

A autoproteólise converte a pró-caspase-1 em caspase-1 ativa, que medeia a morte celular inflamatória ou piroptose. Danos ao DNA durante a piroptose levam à condensação nuclear.

Fixe as células e trate com um detergente para permeabilizá-las.

Adicione um anticorpo primário que se liga à proteína adaptadora associada ao inflamassoma e um anticorpo secundário marcado com fluorescência que se liga ao anticorpo primário, marcando o inflamassoma.

Introduza uma coloração fluorescente de ácido nucleico para rotular o núcleo. Sob um microscópio de fluorescência, as células exibem núcleos condensados - indicando piroptose - e focos de proteínas adaptadoras - indicando a formação de inflamas