Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a morte de macrófagos após a exposição à nigericina

Pegue uma placa de ensaio contendo macrófagos preparados com lipopolissacarídeo.

O priming aumenta a expressão de precursores de citocinas pró-inflamatórias inativas e proteínas NLRP3.

Adicione a nigericina, um ionóforo de potássio, promovendo o efluxo de íons. Isso interrompe os níveis intracelulares de potássio, desencadeando proteínas NLRP3, para formar um grande complexo.

O NLRP3 oligomerizado recruta as proteínas adaptadoras, ASC, causando sua polimerização. Os filamentos ASC recrutam pró-caspase-1, formando NLRP3-inflamassoma, um complexo multiproteico.

A pró-caspase-1 sofre autoativação induzida por proximidade, gerando caspase-1. A caspase-1 cliva a citocina pró-inflamatória e a proteína gasderminina-D, criando um poro da membrana plasmática.

Isso resulta em secreção de citocinas e morte celular programada inflamatória, piroptose, liberando conteúdo intracelular, incluindo lactato desidrogenase ou LDH. Colete o sobrenadante contendo LDH.

Adicione a mistura de substrato - lactato, iodonitrotetrazolium violeta ou corante INT, NAD + e diaforase. O LDH oxida o lactato em piruvato enquanto reduz o NAD+. Diaforase catalisa a redução de INT, formando formazan de cor vermelha.

A intensidade da cor corresponde à liberação de LDH, com níveis elevados indicando aumento do dano celular associado à piroptose e morte.

Para realizar um ensaio de liberação de LDH, adicione 50 microlitros de meio DMEM-5 suplementado com 10 nigericina micromolar em cada poço experimental e 50 microlitros de DMEM-5 nos poços de controle espontâneo e 100% de lise por 60 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 30 minutos, adicione 10 microlitros de tampão de lise 10x aos poços de controle de lise 100% e adicione 10 microlitros de meio aos outros poços. No final da incubação, centrifugue a placa e transfira 50 microlitros de sobrenadante de cada poço para uma placa transparente de fundo plano.

Em seguida, adicione 50 microlitros de substrato recém-descongelado e preparado a cada poço para uma incubação de 30 minutos no escuro, verificando a placa após 15 minutos para confirmar que o sinal não excederá o limite de detecção do leitor de placas. No final da incubação, adicione 50 microlitros de solução de parada a cada poço e meça o OD₄₉₀ em um leitor de placas apropriado para permitir o cálculo da porcentagem de lise celular por poço.