Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:57 min. • July 8th, 2025
Pegue um tubo de vidro contendo homogenato de neutrófilos com componentes intracelulares liberados.
Adicione metanol, um solvente polar, que interrompe as interações lipídio-lipídio e lipídio-proteína. A polaridade inerente do metanol distribui uniformemente os lipídios polares, solubilizando-os. Em seguida, adicione clorofórmio, um solvente orgânico apolar, que interage com lipídios apolares, fazendo com que eles se dispersem e solubilizem.
Centrifugue para separar o pellet contendo proteínas do sobrenadante contendo lipídios, polissacarídeos e detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um tubo de vidro novo. Adicione clorofórmio e água destilada. Centrifugue a amostra.
A adição de água forma espontaneamente um sistema bifásico, particionando biomoléculas nas camadas inferior de clorofórmio e superior de água-metanol
.A camada de clorofórmio compreende lipídios apolares dissolvidos, enquanto a camada superior contém contaminantes não lipídicos e mais lipídios polares. Remova a camada superior de água-metanol sem perturbar a camada que contém lipídios.
Use um concentrador a vácuo para remover o solvente dos lipídios. Armazene em temperaturas mais baixas até uso posterior.
Para isolar os lipídios dos neutrófilos derivados do sangue periférico humano, pegue os neutrófilos preparados e coloque-os no gelo. Pipete os neutrófilos para um tubo de vidro com tampa de rosca de 15 mililitros com vedação de PTFE e homogeneize-os agitando por um minuto. Em seguida, adicione 2 mililitros de metanol, seguidos um minuto depois por 1 mililitro de clorofórmio. Depois de agitar por mais um minuto, gire os tubos de vidro em temperatura ambiente e 50 RPM por 30 minutos.
Em seguida, granular a fração proteica centrifugando a solução a 7 graus Celsius e 1952 vezes g por 10 minutos. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo com tampa de rosca de vidro de 15 mililitros, deixando o pellet contendo proteínas para trás. Armazene o pellet a menos 20 graus Celsius para quantificação futura.
Adicione 1 mililitro de clorofórmio e espere um minuto. Em seguida, adicione 1 mililitro de água bidestilada e inverta o tubo de tampa de rosca de vidro com a amostra por 30 segundos. Depois de centrifugar a amostra como antes, remover e rejeitar a fase superior até à camada turva, mas não incluindo. Seque as amostras em um concentrador a vácuo a 60 graus Celsius e armazene-as a menos 20 graus Celsius até que sejam necessárias.