Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a infecção por Cryptococcus neoformans em macrófagos

Pegue uma placa de vários poços contendo macrófagos.

Adicione Cryptococcus neoformans aos poços de teste, enquanto os poços de controle contêm apenas macrófagos.

Macrófagos fagocitam fungos dentro de fagossomos.

Lave com tampão para remover fungos não fagocitados. Adicione mídia sem antibióticos. Incubar.

O fagossomo se funde com o lisossomo, formando um fagolisossomo. Os fungos modulam o pH do fagolisossomo e possuem mecanismos intrínsecos para sobreviver a condições fagolisossômicas adversas. Os fungos permeabilizam a membrana fagolisossomal e se replicam, acompanhados por acúmulo citosólico de vesículas cheias de polissacarídeos.

A residência e replicação fúngica intracelular causam danos celulares, desencadeando vias de morte celular. Isso causa lise de macrófagos e liberação de conteúdo intracelular, incluindo lactato desidrogenase ou LDH, em meios.

Colete mídia contendo LDH em diferentes momentos. Lise os macrófagos de controle em pontos de tempo semelhantes para liberação máxima de LDH celular. Adicione a mistura de ensaio aos meios e lisatos coletados. O LDH converte lactato em piruvato, reduzindo o NAD⁺. Diaforase reduz o sal de tetrazólio, formando um produto de formazan vermelho.

Usando um leitor de placas, meça a absorbância do formazan para quantificar a lise dos macrófagos após a infecção por Cryptococcus neoformans.

Para preparar as células fúngicas para uma infecção por macrófagos, colete e centrifugue células de C. neoformans de uma cultura de fase intermediária, seguida de três lavagens suaves com 1 mililitro de PBS em temperatura ambiente sob as mesmas condições de centrífuga.

Após a última lavagem, ressuspenda as células fúngicas em 1,2 vezes 10 elevado ao oitavo de células por mililitro, de concentração de meio de cultura de células sem antibióticos, e adicione 1 mililitro de suspensão de células fúngicas a cada um dos 4 poços de uma placa de cultura de macrófagos de 6 poços confluente de 70% a 80%. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por três horas. Incline cuidadosamente a placa para permitir que cada poço seja lavado suavemente três vezes com 1 mililitro de PBS por poço por lavagem.

Para medir a proficiência da infecção após a última lavagem, adicione 1 mililitro de meio livre de antibióticos a cada poço da placa de 6 poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Nos momentos experimentais apropriados, coletar o sobrenadante de cada poço e medir a quantidade de LDH em cada poço de acordo com os protocolos padrão. Ao mesmo tempo, lisar as células de macrófagos não infectadas para determinar o valor de citotoxicidade máxima.

A citotoxicidade pode então ser calculada usando a fórmula indicada.