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Pegue um sistema de infecção de duas câmaras separado por uma inserção de membrana permeável. O compartimento inferior contém queratinócitos humanos aderentes ou células da pele.
Adicione patógenos bacterianos na câmara superior e incuba. A membrana impede o contato direto dos patógenos com os queratinócitos. Os patógenos secretam estreptolisina S ou SLS - uma pequena toxina - que atravessa a membrana para atingir as células.
O cotransportador de bicarbonato de sódio nos queratinócitos medeia o influxo de íons bicarbonato e sódio, mantendo o pH intracelular. O SLS se liga ao cotransportador e interrompe o transporte de íons, levando ao estresse osmótico intracelular.
A sinalização a jusante induzida por estresse causa degradação do inibidor ligado ao Fator Nuclear Kappa B sequestrado, ou NF-κB, levando à sua ativação. O NF-κB ativado se transloca para o núcleo, levando à regulação positiva da produção de citocinas pró-inflamatórias.
Após a secreção extracelular, as citocinas se ligam aos receptores de morte na célula hospedeira, iniciando a necrose. Após a incubação, colher o sobrenadante da cultura para avaliar o impacto da toxina bacteriana.
Imediatamente antes do tratamento, use 1X PBS para lavar as células. Em seguida, aplique 2 mililitros de meio de crescimento fresco com ou sem tratamento farmacológico nas placas de seis poços, ou 0,5 mililitros de meio nos poços das placas de 24 poços. Em seguida, sob uma capela de fluxo laminar, use uma pinça estéril para colocar cuidadosamente uma inserção de membrana permeável estéril de 0,4 mícron em cada poço.
O manuseio cuidadoso e estéril das inserções permeáveis durante a preparação da infecção é fundamental para evitar que a membrana seja comprometida ou contaminada durante esse processo.
Aplicar meio de cultura de células frescas na câmara superior de cada poço, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, aplique um volume apropriado das culturas bacterianas normalizadas na câmara superior do sistema de inserção de membrana permeável e aplique meio bacteriano nos poços de controle.
A adição cuidadosa das bactérias à câmara superior, bem como o transporte suave das células infectadas para a incubadora, são essenciais, pois é essencial que as bactérias não contaminem a câmara inferior durante a configuração experimental.
Para avaliar as proteínas secretadas do hospedeiro, use uma pinça estéril para remover cuidadosamente a inserção da membrana permeável. Em seguida, sem perturbar a monocamada de células, colete o meio da câmara inferior em tubos de 1,5 mililitro.
Centrifugue as amostras a 14.000 RCF e 4 graus Celsius por 10 minutos para granular detritos celulares. Em seguida, remova tudo, exceto 50 microlitros do sobrenadante, transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro e armazene a menos 20 graus Celsius ou use imediatamente.