Extraindo lisado de células hospedeiras de células hospedeiras infectadas cultivadas em um sistema de membrana permeável

Comece semeando células hospedeiras de mamíferos no compartimento inferior de um sistema de membrana permeável.

Adicione Streptococcus - uma bactéria patogênica conhecida por secretar estreptolisina S ou toxina SLS, à inserção da membrana. A toxina SLS se difunde através do poro da membrana e atinge a célula hospedeira.

Os cotransportadores de sódio-bicarbonato ligados à membrana regulam o transporte de íons, mantendo a homeostase celular. A toxina se liga a esses cotransportadores, interrompendo o transporte de íons e causando estresse osmótico nas células hospedeiras.

Isso ativa várias cascatas de sinalização a jusante, incluindo p38 MAPK, uma via de proteína quinase ativada por mitógeno. A p38 MAPK ativada fosforila seus alvos a jusante, iniciando uma resposta celular contra a bactéria.

Em seguida, remova a inserção da membrana permeável. Aspire o meio acima das células hospedeiras. Adicione tampão de lise para liberar o conteúdo celular. Centrifugue para pellet os restos da célula.

Recolher o sobrenadante que contém os componentes do lisado solúvel e o sedimento que contém os componentes do lisado insolúvel. Armazene as amostras para análise posterior.

Imediatamente antes do tratamento, use 1X PBS para lavar as células. Em seguida, aplique 2 mililitros de meio de crescimento fresco com ou sem tratamento farmacológico nas placas de seis poços, ou 0,5 mililitros de meio nos poços das placas de 24 poços. Em seguida, sob uma capa de fluxo laminar, use uma pinça estéril para colocar cuidadosamente uma inserção de membrana permeável estéril de 0,4 mícron em cada poço.

O manuseio cuidadoso e estéril das inserções permeáveis durante a preparação da infecção é fundamental para evitar que a membrana fique comprometida ou contaminada durante esse processo.

Aplicar meio de cultura de células frescas na câmara superior de cada alvéolo de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, aplique um volume apropriado das culturas bacterianas normalizadas na câmara superior do sistema de inserção de membrana permeável e aplique meio bacteriano nos poços de controle.

A adição cuidadosa das bactérias à câmara superior, bem como o transporte suave das células infectadas para a incubadora, são essenciais, pois é essencial que as bactérias não contaminem a câmara inferior durante a configuração experimental.

Use uma pinça estéril para remover cuidadosamente a inserção da membrana permeável.

Para avaliação dos lisados das células hospedeiras, aspire suavemente o meio acima da monocamada sem perturbar as células hospedeiras. Em seguida, use PBS para enxaguar as células uma vez. Aspire suavemente o PBS e aplique imediatamente um volume de tampão de lise gelado para atingir, por exemplo, uma concentração de proteína de 0,5 a 1,5 miligramas por mililitro. Em seguida, incube as amostras no gelo por 15 minutos.

Em seguida, use um raspador de células para separar as células da superfície da placa de cada poço e transfira todo o conteúdo de cada poço para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 RCF e 4 graus Celsius por 20 minutos.

Para avaliar os componentes do lisado solúvel, transfira o sobrenadante para um tubo novo e armazene a 20 graus Celsius negativos ou use imediatamente. Para avaliar componentes nucleares ou outros componentes insolúveis do lisado, reserve o pellet e armazene a menos 20 graus Celsius, ou use imediatamente.