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Pegue uma câmara de imagem contendo uma cultura de células epiteliais humanas carregadas com um indicador fluorescente de cálcio intracelular.
Adicione um meio de crescimento contendo íons de cálcio. Introduza Shigella, uma bactéria patogênica, e incuba.
O sistema de secreção bacteriana penetra na célula hospedeira e libera efetores de invasão. A invasão desencadeia o rearranjo da actina, formando membranas que se agitam ao redor das bactérias.
No local da invasão, a fosfolipase C, ou PLC, na membrana plasmática é ativada e os receptores de trifosfato de inositol se agrupam no retículo endoplasmático ou RE.
O PLC hidrolisa o fosfatidilinositol de membrana 4,5-bifosfato em trifosfato de inositol, ou IP3, que se acumula localmente devido à densa malha de actina.
O IP3 se liga aos receptores no RE, causando liberação de cálcio. Os indicadores de cálcio se ligam aos íons liberados e emitem fluorescência, exibindo uma resposta local de cálcio.
O IP3 se difunde lentamente através da actina, esgotando ainda mais o nível de cálcio do RE e ativando um canal de cálcio da membrana plasmática, levando ao influxo de cálcio.
A fluorescência na célula indica atraso na resposta global do cálcio.
Coloque a lamínula contendo as células Fluo-4 em uma câmara de imagem ou com fundo de vidro. Use tampão EM para lavar a amostra três vezes para remover compostos potencialmente resultantes da lise celular. Em seguida, adicione um mililitro de buffer EM. Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência invertida stage, aquecido a 33 graus Celsius. Selecione um campo de microscopia e configure os parâmetros de aquisição, incluindo tempo de exposição e binning, se necessário, para otimizar o sinal fluorescente Fluo-4.
Para adicionar bactérias à amostra, remova cuidadosamente 500 microlitros de tampão EM da câmara e adicione 500 microlitros da suspensão bacteriana para obter um OD600 final de 0,05. Execute imediatamente uma aquisição ou aguarde 10 minutos para permitir que as bactérias sedimentem nas células. No final do fluxo de aquisição, adquira uma imagem de contraste de fase do campo selecionado para visualizar as bactérias em contato com as células e os babados da membrana associados aos locais de invasão bacteriana.
Repita o procedimento de aquisição em intervalos que sejam favoráveis à duração das aquisições de imagem, salvamento de arquivo e seleção de um novo campo para cobrir todo o processo. No final do procedimento de aquisição, adicionar à amostra dois micromolares do ionóforo de cálcio ionomicina para determinar a amplitude máxima dos sinais de cálcio. Adquira imagens a cada 3 a 5 segundos até que o sinal se estabilize, geralmente por menos de 10 minutos.
Em seguida, adicione o quelante de cálcio EGTA a uma concentração final de 10 milimolares para determinar o sinal fluorescente na ausência de cálcio. Adquira imagens a cada 3 a 5 segundos até a estabilização do sinal, geralmente por menos de 10 minutos. Realize a análise de imagem de acordo com o protocolo de texto.