Análise de sinapses imunes entre células T humanas e células Raji carregadas com SEB usando citometria de fluxo de imagem
JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:28 min • July 8th, 2025
Pegue tubos de citometria de fluxo contendo células Raji descarregadas e Staphylococcus aureus enterotoxina B ou células Raji carregadas com SEB.
Essas células Raji carregadas de SEB funcionam como células B apresentadoras de antígenos substitutos contendo o superantígeno SEB complexado a moléculas de MHC de classe II.
Incubar com pan-leucócitos.
Os receptores de células T, TCRs nas células T, ligam-se aos SEBs nas células Raji, que, juntamente com os sinais co-estimulatórios, estabelecem uma junção célula-célula estável, uma sinapse imune, levando à ativação das células T.
Isso desencadeia vias de sinalização intracelular, causando o rearranjo do citoesqueleto de actina, com o agrupamento de moléculas de sinalização e receptores de superfície dentro da sinapse.
Após a incubação, fixe as células para preservar suas estruturas celulares. Permeabilize as células para acessar alvos intracelulares.
Adicione anticorpos anti-CD3 marcados com fluoróforo, faloidina e DAPI, que se ligam ao CD3 no complexo TCR, filamentos de actina e DNA, respectivamente.
Usando um citômetro de fluxo de imagem, visualize sinais fluorescentes de CD3 e actina para determinar seu enriquecimento na sinapse na presença de SEB.
Comece misturando um mililitro de sangue periférico humano recém-coletado com 30 mililitros de tampão de lise ACK em um tubo cônico de 50 mililitros. Após oito minutos em temperatura ambiente, encha o tubo com PBS para uma lavagem de centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de cultura para uma incubação de 60 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, adicione 5 x 105 Staphylococcus aureus enterotoxina B ou células Raji carregadas ou descarregadas de SEB em 500 microlitros de meio de cultura em tubos FACS individuais, seguidos por 650 microlitros de pan-leucócitos. Gire as co-culturas e ressuspenda os pellets em 150 microlitros de meio de cultura fresco para uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, subtraia suavemente as células por 10 segundos a 100 RPM enquanto adiciona 1,5 mililitros de paraformaldeído a 1,5%. Após 10 minutos à temperatura ambiente, pare a fixação com um mililitro de PBS suplementado com 1% de BSA e colete as células por centrifugação. Ressuspenda os pellets em 100 microlitros de PBS mais BSA e 0,1% de saponina e adicione as amostras de células a dois poços individuais de uma placa de fundo em U de 96 poços.
Após 15 minutos à temperatura ambiente, centrifugue a placa e ressuspenda os pellets em 50 microlitros de PBS mais BSA e saponina, contendo os anticorpos conjugados com fluoróforo ou compostos de interesse para uma incubação de 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em 150 microlitros de PBS mais BSA e saponina, e ressuspenda os pellets em 60 microlitros de PBS.
Para obter imagens das células por citometria de fluxo, abra o software de análise, verifique o nível do líquido e clique em Iniciar no menu do instrumento. Em seguida, clique em Carregar e carregue as amostras na porta quando solicitado.
Na guia Iluminação, altere a potência do laser de excitação para os comprimentos nanométricos apropriados. Em seguida, ajuste as portas para os canais 4 e 11 e ajuste a área para o canal 1.
Para avaliar os ajustes de gating e potência do laser, alterne o menu View para o respectivo portão e ajuste os portões e as potências do laser até que as células e os pares de células estejam visíveis. Em seguida, na guia Aquisição de arquivo, defina o nome da amostra, o número de imagens a serem adquiridas e a porta apropriada para a coloração de CD3 e clique em Adquirir para iniciar a aquisição.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para estudar a ativação de linfócitos T utilizando células Raji carregadas com SEB como células B apresentadoras de antígeno simuladas. O processo envolve citometria de fluxo para visualizar a formação da sinapse imunológica e o engajamento do receptor de linfócito T.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Citometria de Fluxo
Contexto
- As células Raji podem ser carregadas com superantígenos como SEB.
- A ativação dos linfócitos T requer tanto o reconhecimento do antígeno quanto sinais coestimulatórios.
- As sinapses imunológicas são fundamentais para respostas eficazes dos linfócitos T.
- A citometria de fluxo permite uma análise detalhada das interações celulares.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos de ativação de linfócitos T.
- Visualizar a formação de sinapses imunológicas.
- Avaliar o papel da EBSS no engajamento do receptor de linfócitos T.
Métodos Utilizados
- Preparação de células Raji carregadas e não carregadas com SEB.
- Co-cultivo de células Raji com leucócitos pan.
- Fixação e permeabilização de células para coloração com anticorpos.
- Análise por citometria de fluxo para visualizar a dinâmica do TCR e da actina.
Resultados Principais
- Formação bem-sucedida de sinapses imunológicas entre células T e células Raji carregadas com SEB.
- Visualização do enriquecimento de CD3 e actina na sinapse.
- Demonstração das vias de sinalização de ativação das células T.
- Análise quantitativa das respostas das células T ao SEB.
Conclusões
- Células Raji carregadas com SEB imitam efetivamente células apresentadoras de antígeno.
- A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa para estudar interações de linfócitos T.
- Compreender a dinâmica da sinapse imunológica é crucial para a pesquisa imunológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a avaliação quantitativa da formação da sinapse imunológica, um evento inicial crítico na ativação de linfócitos T, apoiando a validação de alvos no descobrimento de imunomoduladores. Ao visualizar o enriquecimento de CD3 e actina por citometria de fluxo com imagem, o método fornece desvio mecanicista de riscos para biológicos que visam vias de sinalização do TCR. A abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos de engajamento imunológico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses de sinalização dependente do TCR por meio da visualização direta da formação da sinapse imunológica.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de alvos ao confirmar a ativação de linfócitos T dependente de antígeno e de sinalização coestimulatória.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos de candidatos imunomoduladores por meio de métricas quantitativas da sinapse.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas validados de interação entre linfócitos T e APCs para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Valor Operacional: Fornece leituras padronizadas e reprodutíveis da formação de sinapses para otimização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite o uso escalonável da plataforma na evolução de "acertos para liderança" de imunomoduladores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar interações entre linfócitos T e linfócitos B em vias impulsionadas por superantígenos.
- Valor Científico: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio da dinâmica quantificável das sinapses imunológicas.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao vincular o engajamento inicial do alvo às respostas funcionais dos linfócitos T.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da triagem de ligação ao alvo até a otimização de compostos líderes, particularmente para imunomoduladores e adjuvantes de vacinas.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações TCR-pMHC e coestimulatórias em contextos imunológicos humanos.
- Triagem: Oferece sistemas prontos para ensaios com saídas de imagem quantitativa para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Fornece métricas de enriquecimento de CD3 e actina que permitem análise comparativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da modelagem da formação do sinapse imunológico humano in vitro.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de citometria de fluxo com imagem para perfilamento imunológico em diferentes áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na ativação de linfócitos T.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade das medições da sinapse imunológica entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer leituras funcionais precoces sobre a eficácia de imunomoduladores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados quantitativos de formação de sinapses.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imunologia, citometria de fluxo e protocolos de coloração fluorescente.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo com capacidade de imagem e controles de compensação para painéis multicoloridos.
- Necessita padronização da preparação celular e do tempo de incubação para detecção reprodutível da sinapse.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a células imunes primárias ou linhagens celulares relevantes para doenças.
- Limitado pela necessidade de co-cultivos celulares viáveis e condições ideais de carregamento de SEB para resultados consistentes.
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Última atualização: 29 agosto 2026