Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:53 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo monocamadas de células epiteliais aderentes. Substitua o meio por meio sem soro, evitando a interferência das proteínas séricas. Pós-incubação, remova a mídia. Lave as células com tampão. Adicione meios sem soro resfriados contendo vitronectina. Incubar em temperaturas mais baixas.
O domínio RGD N-terminal da vitronectina liga-se aos receptores de integrina da superfície celular epitelial. Temperaturas mais baixas inibem a internalização celular do complexo vitronectina-integrina.
Após a saturação do receptor de integrina, remova o meio. Lave com tampão para remover o excesso de vitronectina, que pode afetar a ligação bacteriana da integrina dependente de vitronectina.
Adicione a suspensão de Haemophilus influenzae tipo f, ou Hif, um patógeno bacteriano gram-negativo. Incubar.
A proteína H na superfície do Hif se liga ao terminal C da vitronectina, facilitando a adesão do Hif à célula epitelial e subsequente internalização.
Remova a mídia e lave com tampão para remover o Hif não ligado. Use uma enzima de descolamento celular para colher as células. Adicione meios contendo soro para interromper a reação enzimática. Transfira a suspensão da célula para um tubo de vidro contendo contas de vidro. Vórtice para lisar as células, liberando bactérias internalizadas e ligadas à superfície.
Diluir o lisado com meio sem soro e semear em um prato de ágar chocolate. Incube para Hif para formar colônias. Conte as colônias.
Um número maior de colônias indica maior adesão do Hif às células epiteliais na presença de vitronectina.
Cultura de células epiteliais A549 conforme descrito no protocolo de texto. Após uma lavagem e tripsinização das células a 37 graus Celsius, diluir a suspensão celular para 5.000 células por mililitro usando meio completo contendo 5 microgramas por mililitro de gentamicina.
Antes da infecção bacteriana, substitua o meio nos poços por meio F12 e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Lave a monocamada de células três vezes com 1 mililitro de PBS em temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa no gelo e adicione 200 microlitros de meio F12 pré-resfriado, contendo 10 microgramas por mililitro de vitronectina.
Depois de incubar a placa a 4 graus Celsius por 1 hora, descarte a solução pipetando e lave a camada celular duas vezes com 1 mililitro de PBS em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de Hif selvagem recém-cultivado em meio F12 a cada poço. Incube a placa por 2 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire o meio com uma pipeta e lave as células epiteliais A549 três vezes com PBS a 50 microlitros por poço de solução de descolamento celular e siga com uma incubação de 5 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 50 microlitros de meio completo F12 por poço para interromper a reação enzimática. Transfira as células epiteliais de cada poço para um tubo de vidro de 6 mililitros contendo 4 contas de vidro. Lisar as células à temperatura ambiente por vórtice por 2 minutos.
Depois de diluir o lisado celular 100 vezes, coloque 10 microlitros da amostra diluída em uma placa de ágar chocolate. Conte as colônias após uma incubação noturna a 37 graus Celsius.