Um ensaio para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana às células epiteliais do hospedeiro

Pegue uma placa de vários poços contendo monocamadas de células epiteliais aderentes. Substitua o meio por meio sem soro, evitando a interferência das proteínas séricas. Pós-incubação, remova a mídia. Lave as células com tampão. Adicione meios sem soro resfriados contendo vitronectina. Incubar em temperaturas mais baixas.

O domínio RGD N-terminal da vitronectina liga-se aos receptores de integrina da superfície celular epitelial. Temperaturas mais baixas inibem a internalização celular do complexo vitronectina-integrina.

Após a saturação do receptor de integrina, remova o meio. Lave com tampão para remover o excesso de vitronectina, que pode afetar a ligação bacteriana da integrina dependente de vitronectina.

Adicione a suspensão de Haemophilus influenzae tipo f, ou Hif, um patógeno bacteriano gram-negativo. Incubar.

A proteína H na superfície do Hif se liga ao terminal C da vitronectina, facilitando a adesão do Hif à célula epitelial e subsequente internalização.

Remova a mídia e lave com tampão para remover o Hif não ligado. Use uma enzima de descolamento celular para colher as células. Adicione meios contendo soro para interromper a reação enzimática. Transfira a suspensão da cé