Uma técnica para a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe por meio de um sistema de mamíferos

Partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, imitam a estrutura do vírus, mas não possuem material genético viral, tornando-as não virulentas. As VLPs possuem epítopos antigênicos ligados à superfície reconhecidos pelas células imunológicas, tornando-as candidatas ideais a vacinas.

Para gerar VLPs de influenza recombinantes, use vetores de expressão eucariótica.

Dois vetores contêm genes que codificam para hemaglutinina, ou HA, e neuraminidase, ou NA - proteínas estruturais do vírus influenza. O terceiro vetor contém o gene gag, que codifica as proteínas centrais do vírus da imunodeficiência humana.

Adicione um reagente de transfecção à base de lipídios catiônicos. O grupo de cabeça lipídica carregada positivamente interage com o DNA carregado negativamente, formando uma bicamada ao redor dos vetores - gerando complexos de transfecção de lipossomas.

Adicione complexos em células hospedeiras de mamíferos cultivadas adequadas para a produção de VLP e incuba. Os complexos de transfecção entram nas células por meio da endocitose - a membrana do lipossomo se funde com a membrana do endossomo para liberar os vetores no citoplasma.

Os vetores entram no núcleo, levando à expressão dos genes virais. Após a síntese de HA e NA no retículo endoplasmático, as proteínas se translocam para a membrana plasmática através da via secretora.

As proteínas centrais são sintetizadas no citoplasma e transportadas para o local de montagem para ancorar na membrana plasmática. Os componentes virais acumulados sofrem automontagem em VLPs e brotam da célula hospedeira.

Colha os VLPs liberados para processamento downstream.

No dia da transfecção, prepare soluções de lipossomas e DNA de acordo com as recomendações do fabricante. Transfectar as células de ADN com uma composição de ADN de 1:1:2 de HA:NA:Gag e uma quantidade total de ADN de 40 microgramas por balão T-150. Repita esta etapa para criar nove frascos T-150 para um volume total de 200 mililitros.

Em seguida, diluir as soluções de DNA e lipossomas em meios de transfecção sem soro sem antibióticos, de modo que cada frasco contenha um volume total de 24 mililitros. Retorne os frascos à incubadora e mantenha as células em meio de cultura de transfecção até o dia da colheita da partícula semelhante a um vírus ou VLP.

Transfira o sobrenadante para tubos cônicos de 15 mililitros para colher a cultura das células após 72 a 96 horas após a transfecção. Gire as células para baixo para pellet os detritos celulares. Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de poros de 0,22 mícron.