JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:45 min • July 8th, 2025
Comece com um camundongo anestesiado que foi injetado por via intraperitoneal com lipopolissacarídeo para induzir inflamação.
Incise o abdômen para expor a cavidade abdominal. Mantenha a hidratação do órgão com solução salina. Injete rodamina 6G retroorbitalmente. As moléculas de corante fluorescente entram na circulação e marcam leucócitos e plaquetas para sua visualização.
Agora, exteriorize uma alça de íleo com seus vasos de mesentério. Mantenha o tecido hidratado com solução salina pré-aquecida para obter imagens ideais. Sob um microscópio de fluorescência, concentre-se em uma veia de mesentério para microscopia intravital.
A injeção de lipopolissacarídeo causa ativação de células endoteliais com a regulação positiva de moléculas de adesão, incluindo selectinas. As plaquetas circulantes são recrutadas para o endotélio, onde se ligam por meio de interações molécula-ligante de adesão específicas, formando complexos de adesão.
Devido a essas interações, as plaquetas são ativadas e liberam grânulos contendo moléculas, incluindo a serotonina, promovendo o recrutamento de leucócitos.
Os leucócitos se movem para a superfície endotelial e se ligam às plaquetas ativadas. Além disso, os leucócitos rolam ao longo do endotélio e se ligam às células endoteliais por meio de interações adesivas fracas. O movimento de rolamento ativa as integrinas leucocitárias para uma adesão firme às células endoteliais, cruciais para a transmigração leucocitária-endotelial.
Usando microscopia intravital, visualize os leucócitos fluorescentes e plaquetas para determinar suas interações em tempo real com as células endoteliais.
Quatro horas antes da imagem intravital, injete 20 miligramas por quilograma de LPS IP em um camundongo macho de 16 a 20 gramas, de 4 a 6 semanas, para induzir a resposta inflamatória bacteriana simulada.
Pré-aqueça uma solução salina a 0,9% em banho-maria a 37 graus Celsius para umidificar a câmara de plástico e o tecido do mesentério também neste momento. Em seguida, confirme a profundidade apropriada da anestesia por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no camundongo tratado com LPS e, em seguida, aplique pomada nos olhos do animal.
Depile o abdômen com um barbeador, removendo qualquer cabelo solto com gaze embebida em etanol a 70%. Em seguida, use uma pequena pinça curva e uma tesoura para abrir o abdômen.
Identifique os vasos epigástricos e abra o peritônio na região da linha alba para proteger os vasos. Aplique algumas gotas de solução salina pré-aquecida na cavidade abdominal para manter o tecido úmido, seguido de uma injeção retro-orbital de 50 microlitros de rodamina 6G para marcar as células sanguíneas circulantes. Em seguida, coloque o camundongo em uma placa de Petri de 10 centímetros, exteriorize uma alça de íleo e administre a solução salina pré-aquecida a cada dois minutos para manter o tecido úmido.
Para visualizar a resposta inflamatória por microscopia intravital, coloque o camundongo embaixo do microscópio e traga uma veia de mesentério com diâmetro de 200 a 300 micrômetros e o mínimo possível de gordura circundante visível para o campo de visão.
Usando o software de microscópio apropriado, registre as interações célula-endotélio por 1 minuto em 4 veias diferentes por camundongo. Em seguida, para analisar as respostas célula a célula, confirme as condições de fluxo sanguíneo estáveis e interindividualmente.
Para quantificar o número de leucócitos rolantes, desenhe uma linha vertical através da veia e conte manualmente todos os leucócitos que cruzam essa linha em 1 minuto. Para determinar a velocidade de rolamento, desenhe duas linhas verticais através da veia a 50 micrômetros de distância e meça o tempo que um único leucócito leva para cruzar entre as linhas enquanto rola de forma estável no endotélio.
Para medir a adesão leucocitária, desenhe um quadrado de 200 por 200 micrômetros na veia. Em seguida, conte manualmente os leucócitos firmemente aderentes que não exibem nenhum movimento visível dentro do quadrado por 30 segundos. Finalmente, para quantificar as interações plaqueta-leucócitos, conte manualmente o número de plaquetas ligadas a um leucócito.