Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em larvas de insetos

Coloque uma larva de Galleria mellonella - a mariposa da cera maior - em uma plataforma de injeção, expondo o lado ventral.

Pegue uma microsseringa contendo uma suspensão de Mycobacterium bovis BCG lux - uma cepa de vacina bacteriana viva geneticamente modificada para produzir bioluminescência. Injete a suspensão no último proleg, ou apêndices abdominais - liberando bactérias na hemolinfa - fluido circulatório na cavidade corporal.

Transfira a larva para um ambiente controlado e incuba. As bactérias utilizam a hemolinfa como uma rica fonte de nutrientes e se multiplicam.

Os hemócitos - células imunes invertebradas na hemolinfa - agrupam-se em torno da bactéria, formando uma estrutura semelhante a um granuloma para evitar a propagação da infecção. Os hemócitos liberam pró-fenoloxidase, que sofre clivagem proteolítica para formar fenoloxidase.

A fenoloxidase sintetiza melanina, que sequestra a bactéria no local da infecção. A deposição de pigmento melanina causa melanização sistêmica, escurecendo a cor larval

.

Os hemócitos engolfam as bactérias em fagossomos. Os fagossomos se fundem com os lisossomos para adquirir enzimas líticas, causando degradação bacteriana. Um subconjunto de bactérias pode escapar da degradação fagolisossômica e residir nos hemócitos - levando a uma infecção persistente.

Meça a bioluminescência bacteriana em intervalos definidos. Um declínio inicial na bioluminescência indica uma resposta antibacteriana eficaz, enquanto o platô do valor indica uma infecção persistente.

Mantenha as larvas de ínstar compradas no escuro a 18 graus Celsius na chegada e use dentro de uma semana após a compra. Identifique e selecione larvas saudáveis para experimentação com base na cor creme uniforme, tamanho e peso apropriados, alta motilidade e possuindo a capacidade de se endireitar quando viradas. Usando uma pinça sem corte, conte cuidadosamente as larvas saudáveis em uma placa de Petri forrada com uma camada de papel de filtro e guarde em temperatura ambiente no escuro até o uso.

Prepare a plataforma de injeção colando um papel de filtro circular de 94 milímetros de diâmetro em uma superfície plana e elevada. Aspire três volumes de etanol a 70% em uma microseringa de 25 microlitros para esterilizar, descartar e enxaguar com três volumes de PBST estéril. Em seguida, ressuspenda o inóculo BCG lux preparado e aspire 10 microlitros na microsseringa esterilizada. Use uma seringa separada para aspirar PBST para um controle negativo.

Após 10 injeções, ressuspenda o inóculo BCG lux para garantir uma suspensão celular uniforme. Use uma pinça para pegar uma larva e colocá-la na plataforma de injeção. Na plataforma, vire a larva de costas e imobilize prendendo a cabeça e a cauda com a pinça. Localize a última properna esquerda em contagem regressiva a partir da cabeça da larva e insira cuidadosamente a ponta da agulha com 5 a 6 mm de profundidade em um ângulo de 10 a 20 graus em relação ao plano horizontal. Injete o inóculo da seringa.

Após cada infecção, transfira a larva infectada para uma placa de Petri forrada com uma camada de papel de filtro. Uma única placa de Petri de 94 milímetros pode acomodar até 30 larvas. Armazene a placa de Petri em uma caixa escura ventilada dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Monitore a sobrevivência das larvas a cada 24 horas. As larvas são consideradas mortas quando não conseguem se mover em resposta ao toque. Registre a sobrevida e avalie a significância estatística com um teste de Mantel-Cox.