Medição da carga in vivo de bactérias que expressam luciferase em uma larva de inseto

Para medir a carga bacteriana in vivo, comece com larvas de insetos esterilizadas pré-infectadas com Bacillus Calmette-Guérin ou BCG lux. BCG lux é uma cepa de Mycobacterium bovis BCG geneticamente modificada que expressa luciferase - uma enzima produtora de bioluminescência.

Transfira uma larva de inseto para um tubo de matriz de lise contendo tampão com esferas de aço. Usando um homogeneizador, homogeneizar a larva, liberando os componentes intracelulares, incluindo bactérias, no tampão.

Centrifugue o tubo para coletar o homogeneizado e transfira-o para um tubo de luminômetro.

Lave o tubo da matriz com um tampão contendo detergente para solubilizar fragmentos celulares e liberar bactérias residuais.

Combine as frações no mesmo tubo de luminômetro e adicione o substrato de luciferase. Os substratos entram nas bactérias e interagem com as enzimas luciferase, resultando em bioluminescência. Carregue o tubo em um luminômetro e meça a bioluminescência.

O luminômetro mede a intensidade da luz emitida e calcula a unidade de luz relativa, ou RLU - indicativa da carga in vivo de BCG em uma larva de inseto.

Espalhe a suspensão homogeneizada diluída em uma placa de ágar contendo piperacilina e incube para cultivar seletivamente BCG como colônias distintas. As colônias na placa representam a unidade formadora de colônias, ou UFC. A razão RLU para UFC correlaciona a bioluminescência com a viabilidade bacteriana.

A cada 24 horas, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas e use um cotonete embebido em etanol a 70% para esterilizar suavemente as superfícies larvais. Coloque as larvas individualmente em tubos de matriz de lise de dois mililitros contendo 800 microlitros de PBS estéril. Em seguida, use um homogeneizador para homogeneizar as larvas por 60 segundos a seis metros por segundo.

Centrifugue os tubos de lise a 3.500 vezes g por cinco segundos para remover o homogeneizado das tampas e decantar cuidadosamente o homogeneizado em cinco tubos de luminômetro estéreis individualmente. Reserve 100 microlitros de homogenato em um tubo de reação estéril de 1,5 mililitro. Recuperar qualquer homogenato restante lavando os tubos da matriz de lise com um mililitro de PBST e pipetar para os tubos do luminômetro correspondentes.

Agite os tubos do luminômetro e meça a bioluminescência dos homogeneizados em um luminômetro. Em seguida, prepare diluições seriais de 10 vezes dos 100 microlitros reservados de homogenato em placas de cultura de 24 poços usando PBST. Pipete 10 microlitros da diluição em cada placa de ágar Middlebrook 7H11 e use um espalhador de placa estéril para espalhar. Incube a 37 graus Celsius por duas semanas.

Depois disso, conte as unidades formadoras de colônias.