Medição da carga in vivo de bactérias que expressam luciferase em uma larva de inseto

Para medir a carga bacteriana in vivo, comece com larvas de insetos esterilizadas pré-infectadas com Bacillus Calmette-Guérin ou BCG lux. BCG lux é uma cepa de Mycobacterium bovis BCG geneticamente modificada que expressa luciferase - uma enzima produtora de bioluminescência.

Transfira uma larva de inseto para um tubo de matriz de lise contendo tampão com esferas de aço. Usando um homogeneizador, homogeneizar a larva, liberando os componentes intracelulares, incluindo bactérias, no tampão.

Centrifugue o tubo para coletar o homogeneizado e transfira-o para um tubo de luminômetro.

Lave o tubo da matriz com um tampão contendo detergente para solubilizar fragmentos celulares e liberar bactérias residuais.

Combine as frações no mesmo tubo de luminômetro e adicione o substrato de luciferase. Os substratos entram nas bactérias e interagem com as enzimas luciferase, resultando em bioluminescência. Carregue o tubo em um luminômetro e meça a bioluminescência.

O luminômetro mede a intensidade da luz emitida e calcula a unidade de luz relativa, ou RLU - indicativa da carga in vivo de BCG em uma larva de inseto.

Espalhe a suspensão homogeneizada diluída em uma placa de ágar contendo piperacilin