JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:41 min • July 8th, 2025
Coloque um camundongo anestesiado na almofada cirúrgica estéril conectada a uma unidade de respiração com um fluxo contínuo de oxigênio e um gás anestésico.
Usando um filtro, carregue a seringa com ar estéril. Prenda uma agulha na seringa e injete ar esterilizado por via subcutânea na parte de trás do mouse para criar uma bolsa de ar dentro das camadas de tecido. Monitore o mouse até a recuperação.
Re-anestesiar o mouse e administrar lipopolissacarídeo, LPS, na bolsa de ar. O LPS se liga ao receptor toll-like 4, TLR-4 nos macrófagos residentes no tecido e nas células dendríticas, ativando-os.
As células ativadas liberam vários mediadores inflamatórios, como citocinas e quimiocinas, que atraem neutrófilos e outras células imunológicas. Esses mediadores também aumentam a permeabilidade vascular dos vasos sanguíneos próximos, permitindo que células imunes e fatores solúveis entrem na bolsa de ar da corrente sanguínea.
À medida que o fluido se acumula dentro da bolsa, ele forma um exsudato composto por células inflamatórias e várias moléculas bioativas.
Eutanasiar o mouse e injetar um tampão de lavagem adequado na bolsa de ar. Colete o exsudato inflamatório em um tubo de microcentrífuga e centrifugue. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células no tampão de lavagem.
Analise o exsudato inflamatório para quantificar a proporção de neutrófilos e determinar a extensão de sua infiltração.
Após a anestesia dos camundongos no dia zero, use um filtro de 0,22 mícron conectado a uma seringa de cinco mililitros para obter um volume de três mililitros de ar esterilizado. Levante a pele posterior do camundongo anestesiado com uma pinça e use subcutaneamente uma agulha de calibre 26 por 3/8 de polegada para injetar três mililitros de ar esterilizado.
Após o tratamento, remova os camundongos da unidade de respiração e coloque-os em uma gaiola bem ajustada. Monitore os ratos para garantir que eles estejam vivos até que comecem a se mover. No terceiro dia, injete mais três mililitros de ar esterilizado na bolsa de ar previamente estabelecida para sustentar a bolsa de ar.
No sexto dia, injete diferentes tratamentos na bolsa de ar. Injete um mililitro de PBS como controle negativo e injete um mililitro de um micrograma por mililitro de LPS como controle positivo para induzir inflamação local. Depois de seis horas, sacrifique os ratos.
Para cada bolsa de ar, injete um mililitro de tampão de lavagem para lavar a bolsa de ar e colete o exsudato inflamatório em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, lave a bolsa de ar com dois mililitros de tampão de lavagem duas vezes e colete o exsudato inflamatório no mesmo tubo de centrífuga.
Centrifugue a 100 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num mililitro de tampão de lavagem. Conte as células para quantificar a proporção de neutrófilos, usando o analisador hematológico automático.