Quantificação da carga de Helicobacter pylori no estômago de um camundongo infectado

Para quantificar a colonização por Helicobacter pylori em um estômago de camundongo infectado, comece com o tecido estomacal achatado contendo as regiões do corpo e do antro, suspenso em meio nutriente para apoiar a viabilidade bacteriana.

Homogeneizar para quebrar o tecido gástrico com a camada de muco, liberando Helicobacter pylori do tecido para o meio. Realizar diluições em série do homogeneizado gástrico resultante utilizando meios.

Obtenha ágar sangue de cavalo seco, HBA, placas, divididas em vários segmentos. As placas HBA são complementadas com uma mistura de antibióticos. Transferir cada diluição homogeneizada para segmentos separados da placa e espalhá-la uniformemente.

Após a secagem, posicione as placas em posição invertida dentro de um frasco de cultura anaeróbica umidificado com misturas de gases especializadas. Incubar.

O ambiente microaerofílico fornecido pelo frasco de cultura anaeróbica em conjunto com os nutrientes HBA facilita o crescimento e a formação de colônias do Helicobacter pylori. Os antibióticos do HBA inibem o crescimento de espécies bacterianas da microbiota gástrica endógena.

Conte as colônias de Helicobacter pylori em segmentos de placa HBA que se enquadram em uma faixa contável específica.

Calcule a carga de Helicobacter pylori no tecido gástrico, indicando a extensão da colonização bacteriana dentro do tecido.

Para contar o número de H. pylori viável no estômago pós-infecção, homogeneizar amostras estomacais armazenadas em BHI e realizar diluições seriadas duplicadas dos homogeneizados gástricos resultantes em caldo fresco estéril.

Divida o ágar sangue de cavalo pré-seco, ou placas HBA, suplementado com antibióticos adicionais em três ou quatro segmentos e, usando uma adaptação da técnica de Miles e Misra, adicione 10 a 100 microlitros de cada diluição homogeneizada do estômago em um segmento de cada placa de ágar. Espalhe os homogeneizados com alças de plástico estéreis e deixe as placas secarem. Em seguida, coloque as placas em posição invertida em potes de gás anaeróbico contendo uma placa de Petri com água e uma bolsa de gás e, em seguida, incube os frascos a 37 graus Celsius por quatro a sete dias.

Quando as colônias puderem ser observadas, enumere os segmentos contendo entre 10 e 100 colônias isoladas.