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Para quantificar a infiltração de células imunes no tecido uropatogênico da bexiga de camundongos infectados com E. coli, coloque o tecido picado em um tampão de digestão contendo colagenase e desoxirribonuclease.
Incube com agitação regular para romper o tecido.
A colagenase digere a matriz extracelular do tecido, liberando células. A desoxirribonuclease degrada o DNA livre interferente.
Após a incubação, adicione tampão com um agente quelante e soro fetal bovino para inativar as enzimas digestivas.
Passe a mistura digerida por uma peneira para remover os restos de tecido e tecido conjuntivo, obtendo uma suspensão unicelular.
Centrifugue e ressuspenda as células em um tampão contendo anticorpos bloqueadores de Fc. Esses anticorpos se ligam aos receptores Fc das células imunes para evitar a ligação inespecífica de anticorpos.
Adicione anticorpos anti-CD45 marcados com fluoróforo, que se ligam à proteína CD45 transmembrana nas células imunológicas.
Centrifugue e passe as células ressuspensas por um filtro de células para remover os agregados celulares.
Usando um citômetro de fluxo, meça os sinais de fluorescência dos anticorpos conjugados com fluoróforo nas células imunes para quantificar a infiltração de células imunes na bexiga.
Para realizar a citometria de fluxo no tecido da bexiga, após isolar a bexiga conforme demonstrado, use uma tesoura para picar bem o tecido. Adicione 1 bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão e, em seguida, agite o tubo para lavar o tecido picado no tampão de digestão e mantenha-o no gelo até que todas as bexigas sejam dissecadas e picadas. Incube as bexigas picadas a 37 graus Celsius por 60 a 75 minutos com agitação vigorosa com as mãos por 5 segundos a cada 15 minutos.
Quando o tecido tem uma aparência vítrea e transparente semelhante a um lenço de papel úmido, a digestão é completa. Inative as enzimas de digestão adicionando 2 a 3 mililitros de tampão de citometria de fluxo gelado e misture suavemente. Em seguida, coloque os tubos no gelo.
Para garantir uma suspensão unicelular e remover qualquer tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo por um filtro de 100 micrômetros colocado em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, com a ponta de um êmbolo de seringa, pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro. Lave o filtro com mais 2 mililitros de tampão de citometria de fluxo e mantenha as amostras no gelo. Em seguida, lave as amostras por centrifugação a 200 vezes g em 4 graus Celsius por 7 minutos.
Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão de citometria de fluxo contendo bloco Fc diluído a 5 microgramas por mililitro e transfira para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após 10 a 15 minutos, adicione 100 microlitros do coquetel de anticorpos desejado a cada amostra. Em seguida, incubar as amostras no gelo, protegido da luz, por 30 a 45 minutos. Lave as amostras por centrifugação a 200 vezes g em 4 graus Celsius por 7 minutos.
Finalmente, ressuspenda os grânulos de células em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo e passe as amostras por um filtro de células de 40 micrômetros em um tubo de poliestireno de 5 mililitros antes da aquisição em um citômetro de fluxo.