JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Comece com uma placa de vários poços contendo células mononucleares de sangue periférico humano, ou PBMCs derivadas de um vírus da imunodeficiência humana ou doador infectado pelo HIV.
As PBMCs contêm várias células imunes, incluindo células T CD4-positivas infectadas pelo HIV com DNA proviral integrado.
Semeie os poços com uma mistura de eritrócitos parasitados por Plasmodium falciparum, ou PfRBCs - expressando antígenos derivados do parasita e hemácias não infectadas.
Durante a incubação, os antígenos dos PfRBCs interagem com os receptores das células imunes, ativando-os e liberando citocinas.
Essas citocinas desencadeiam a sinalização a jusante nas células T CD4, iniciando a transcrição do DNA proviral do HIV e a síntese de novos RNAs virais.
Os RNAs virais e as proteínas do HIV formam partículas virais que brotam, infectando novas células T CD4 e espalhando a infecção pelo HIV.
A infecção progressiva pelo HIV interrompe a secreção de citocinas, prejudicando a resposta imune contra PfRBCs e levando à infecção persistente por malária.
Com o tempo, as hemácias infectadas liberam parasitas que invadem novas hemácias, proliferando parasitas da malária e estabelecendo o modelo de cultura de células de coinfecção malária-HIV.
Para configurar as culturas de coinfecção, comece semeando 1 x 106 de PBMC HIV-positivo e HIV-negativo recém-isolado em 100 microlitros de RPMI-S + por poço em uma placa de 24 poços. Aumente o volume total de cada poço para 500 microlitros com 400 microlitros de RPMI-S+.
Em seguida, em triplicata e em um volume total de 500 microlitros por poço, adicione 3 x 106 glóbulos vermelhos não infectados ou 3 x 106 glóbulos vermelhos parasitados às células infectadas pelo HIV e não infectadas pelo HIV. Coloque a placa de coinfecção em uma incubadora de cultura de células.
Em seguida, após o período de tempo experimental apropriado, peletize as células e colete 700 microlitros de sobrenadante de cultura de cada poço. Centrifugue o sobrenadante para remover quaisquer detritos. Em seguida, alíquota das amostras, se for caso disso; rotule os tubos e congele-os a menos 20 graus Celsius ou menos para análise posterior.