Um sistema repórter de vírus recombinante in vitro para a detecção de infecção viral
JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:56 min • July 8th, 2025
Pegue uma cultura de células de câncer de fígado humano, geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo co-transportador de taurocolato de sódio ou NTCP - um receptor transmembrana.
Adicione o vírus da hepatite B recombinante ou HBV. O vírus compreende um envelope externo contendo proteínas de superfície e um nucleocapsídeo interno envolvendo o genoma. A inserção de um gene repórter de luciferase inibe a capacidade reprodutiva do vírus.
A proteína do envelope viral se liga ao receptor NTCP da célula hospedeira.
O NTCP interage com o receptor do fator de crescimento epidérmico, EGFR, e oligomeriza, induzindo a endocitose do vírus mediada por EGFR.
O envelope viral se funde com a membrana do endossomo para liberar o nucleocapsídeo, que se desmonta no complexo de poros nucleares.
O genoma viral entra no núcleo e se converte em DNA circular covalentemente fechado ou cccDNA - um modelo estável - que codifica proteínas virais, incluindo a luciferase.
Em intervalos predefinidos, colha as células e lise para liberar luciferase intracelular.
Introduza um substrato repórter. A luciferase oxida o substrato, produzindo um sinal.
Um aumento pós-infecção na atividade da luciferase indica expressão contínua do genoma viral.
Células HepG2 em placa, expressando de forma estável taurocolato de sódio, polipeptídeo cotransportador ou NTCP que são suscetíveis à infecção por HBV e incubam a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
Um dia antes da infecção, coloque aproximadamente 5 x 104 células HepG2 / NTCP nos poços de uma placa revestida de colágeno de 96 poços em 0,1 mililitros de meio de cultura. Descongele o HPV recombinante em banho-maria a 37 graus Celsius, até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco.
Prepare o meio para infecção combinando 78 microlitros de meio de cultura fresco, dois microlitros de DMSO, 10 microlitros de 40% de PEG8000 em 1X PBS e 10 microlitros de HPV recombinante. Adicione 100 microlitros de solução recombinante de HBV a cada poço de uma placa de 96 poços.
Um dia após a infecção, use 300 microlitros de PBS para lavar a célula três vezes, para remover a proteína repórter contaminante da fração do vírus. Adicione 200 microlitros de meio de cultura contendo 2% de DMSO às células infectadas e incube por uma semana ou menos.
Para realizar a análise da infecção pelo HBV, uma semana após a infecção, use PBS para lavar as células infectadas três vezes. Adicione 50 microlitros de tampão de lise às células infectadas. Agitar a placa de cultura durante cinco minutos e, em seguida, centrifugar a 2000 vezes g durante cinco minutos. Adicione 50 microlitros do substrato repórter a uma placa de luminômetro e, em seguida, adicione 20 microlitros do lisado celular à placa e misture agitando brevemente. Por fim, coloque a placa no luminômetro e inicie a leitura.
Visão Geral
Este estudo investiga o mecanismo de infecção do vírus da hepatite B (HBV) em células de câncer hepático humano modificadas geneticamente para expressar o polipeptídeo co-transportador de taurocolato de sódio (NTCP). A pesquisa destaca o papel do NTCP no facilitamento da entrada do HBV e na subsequente expressão de proteínas virais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Biologia Celular
- Oncologia
Contexto
- O vírus da hepatite B é uma preocupação significativa para a saúde global.
- O NTCP é um receptor que media a entrada do HBV em células hepáticas.
- Compreender os mecanismos de infecção pelo HBV pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- Ensaios com repórter de luciferase são utilizados para medir a atividade viral.
Objetivo do Estudo
- Elucidar o papel do NTCP na infecção pelo HBV.
- Avaliar a expressão do genoma viral após a infecção.
- Desenvolver um método confiável para estudar o HBV in vitro.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células HepG2 expressando NTCP.
- Infecção com HBV recombinante contendo um gene repórter de luciferase.
- Lise celular e medição da atividade de luciferase.
- Uso de PBS e tampão de lise para o processamento celular.
Resultados Principais
- Infecção bem-sucedida de células HepG2/NTCP pelo HBV.
- O aumento da atividade de luciferase indica expressão contínua do genoma viral.
- A interação da NTCP com o HBV facilita a entrada viral nas células hospedeiras.
- Os ensaios de luciferase fornecem uma medida quantitativa da infecção pelo HBV.
Conclusões
- O NTCP é essencial para a entrada do HBV nas células hepáticas.
- Os ensaios de repórter luciferase são eficazes para estudar a dinâmica do HBV.
- Este modelo pode ser utilizado para pesquisas futuras sobre o HBV e testes de fármacos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção quantitativa da infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) utilizando um sistema recombinante de repórter luciferase permite a medição precisa dos eventos iniciais de entrada e replicação viral em células hepáticas humanas. Essa capacidade sustenta a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta de antivirais. O sistema fornece uma plataforma escalonável e reprodutível para avaliar as interações entre HBV e o hospedeiro e para triar intervenções candidatas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de entrada do HBV por meio da ligação ao receptor NTCP.
- Apóia a validação funcional das interações hospedeiro-vírus essenciais para o direcionamento terapêutico.
- Facilita a eliminação de riscos mecanicistas ao isolar eventos iniciais de infecção da replicação subsequente.
- Fornece leituras quantitativas para a priorização de alvos orientada por hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um ensaio celular validado e reprodutível para detecção de infecção pelo HBV.
- Gera sinais robustos e quantitativos de luciferase adequados para triagem em alto rendimento.
- Padroniza a medição da infecção, permitindo avaliação confiável de compostos e transferibilidade do ensaio.
- Permite escalonamento para triagem de bibliotecas que visam entrada viral ou replicação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha as dinâmicas de infecção in vitro com modelos de células hospedeiras relevantes para a doença.
- Permite a continuidade do descobrimento mecanicista à validação pré-clínica de candidatos antivirais.
- Oferece uma plataforma para avaliar biomarcadores translacionais da infecção por HBV quando apoiada por pontos finais adicionais.
- Reduz o risco biológico ao esclarecer as interações iniciais entre o vírus e o hospedeiro.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema de relatório por vírus recombinante integra-se na interface entre a descoberta inicial e a identificação de compostos promissores, apoiando tanto estudos mecanicistas quanto fluxos de trabalho de triagem para a pesquisa sobre o HBV.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a entrada viral e a replicação inicial, esclarecendo as vias de infecção mediadas pelo NTCP.
- Triagem: Fornece leituras padronizadas e reprodutíveis baseadas em luciferase para avaliação de compostos.
- Análises: Permite medição sensível e quantitativa da cinética de infecção e comparações entre condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao modelar a infecção em células derivadas de fígado humano.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e adaptável para diversas necessidades de pesquisa sobre o HBV e triagem de antivirais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e na compreensão mecanicista da infecção pelo HBV.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios para equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e reduz riscos biológicos em fases avançadas nas carteiras de antivirais.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos direcionados ao HBV e o avanço de candidatos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, manipulação de vírus e ensaios baseados em luminescência.
- Exige acesso a células HepG2 que expressam NTCP e ao vírus repórter recombinante do HBV.
- Exige instrumentação padronizada para detecção do sinal de luciferase e análise de dados.
- A padronização entre equipes nos protocolos do ensaio e na interpretação dos dados é essencial para a reprodutibilidade.
- A adaptação a outros sistemas virais pode exigir validação e otimização adicionais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
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Última atualização: 29 agosto 2026