JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Pegue uma cultura de células de câncer de fígado humano, geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo co-transportador de taurocolato de sódio ou NTCP - um receptor transmembrana.
Adicione o vírus da hepatite B recombinante ou HBV. O vírus compreende um envelope externo contendo proteínas de superfície e um nucleocapsídeo interno envolvendo o genoma. A inserção de um gene repórter de luciferase inibe a capacidade reprodutiva do vírus.
A proteína do envelope viral se liga ao receptor NTCP da célula hospedeira.
O NTCP interage com o receptor do fator de crescimento epidérmico, EGFR, e oligomeriza, induzindo a endocitose do vírus mediada por EGFR.
O envelope viral se funde com a membrana do endossomo para liberar o nucleocapsídeo, que se desmonta no complexo de poros nucleares.
O genoma viral entra no núcleo e se converte em DNA circular covalentemente fechado ou cccDNA - um modelo estável - que codifica proteínas virais, incluindo a luciferase.
Em intervalos predefinidos, colha as células e lise para liberar luciferase intracelular.
Introduza um substrato repórter. A luciferase oxida o substrato, produzindo um sinal.
Um aumento pós-infecção na atividade da luciferase indica expressão contínua do genoma viral.
Células HepG2 em placa, expressando de forma estável taurocolato de sódio, polipeptídeo cotransportador ou NTCP que são suscetíveis à infecção por HBV e incubam a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
Um dia antes da infecção, coloque aproximadamente 5 x 104 células HepG2 / NTCP nos poços de uma placa revestida de colágeno de 96 poços em 0,1 mililitros de meio de cultura. Descongele o HPV recombinante em banho-maria a 37 graus Celsius, até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco.
Prepare o meio para infecção combinando 78 microlitros de meio de cultura fresco, dois microlitros de DMSO, 10 microlitros de 40% de PEG8000 em 1X PBS e 10 microlitros de HPV recombinante. Adicione 100 microlitros de solução recombinante de HBV a cada poço de uma placa de 96 poços.
Um dia após a infecção, use 300 microlitros de PBS para lavar a célula três vezes, para remover a proteína repórter contaminante da fração do vírus. Adicione 200 microlitros de meio de cultura contendo 2% de DMSO às células infectadas e incube por uma semana ou menos.
Para realizar a análise da infecção pelo HBV, uma semana após a infecção, use PBS para lavar as células infectadas três vezes. Adicione 50 microlitros de tampão de lise às células infectadas. Agitar a placa de cultura durante cinco minutos e, em seguida, centrifugar a 2000 vezes g durante cinco minutos. Adicione 50 microlitros do substrato repórter a uma placa de luminômetro e, em seguida, adicione 20 microlitros do lisado celular à placa e misture agitando brevemente. Por fim, coloque a placa no luminômetro e inicie a leitura.