Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:33 min. • July 8th, 2025
Pegue um slide de canal contendo macrófagos de camundongo. O canal se conecta a reservatórios cheios de meios, fornecendo nutrientes aos macrófagos.
Substitua o meio por anticorpos marcados com fluorescência contendo meio, que se ligam a glicoproteínas de superfície específicas, marcando macrófagos.
Pegue glóbulos vermelhos humanos, hemácias, com membranas celulares marcadas com fluorescência. Oponize as hemácias com anticorpos IgG de camundongo, que se ligam especificamente à glicoforina A.
Adicione as hemácias opsonizadas para IgG à lâmina contendo macrófagos. Os receptores Fc de macrófagos se ligam à região Fc de IgGs nas hemácias, resultando no agrupamento de receptores Fc ao redor da área de contato e marcando as hemácias para fagocitose.
A ligação desencadeia vias de sinalização intracelular e ativa GTPases. As GTPases ativadas impulsionam a reorganização e polimerização da actina, formando saliências de membrana finas denominadas filopódios.
Além disso, os filopódios se estendem ao redor do RBC, envolvendo-o dentro do copo fagocítico em desenvolvimento. As bordas do copo se fundem, formando um fagossomo que internaliza as hemácias opsonizadas para degradação.
Usando um microscópio confocal, obtenha imagens de lapso de tempo de eventos fagocíticos únicos.
Para rotular os macrófagos peritoneais, substitua o meio de bicarbonato em cada lâmina de canal por meio completo suplementado com HEPES e incline a lâmina para permitir que 100 microlitros do anticorpo específico de macrófagos de camundongo marcado com fluorescência de interesse sejam adicionados gota a gota à abertura do canal de 100 microlitros da lâmina. Aspire o meio que flui para o reservatório a jusante e incube as células por 20 minutos em uma câmara úmida a 37 graus Celsius na ausência de dióxido de carbono.
Enquanto as células peritoneais estão sendo marcadas, misture suavemente a amostra de 4 a 2.000 glóbulos vermelhos e transfira 400 microlitros das células para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros em um bloco de alumínio aquecido dentro de uma capela de fluxo laminar por cerca de 5 a 8 minutos.
Quando as células tiverem aquecido a 37 graus Celsius, misture 0,4 microlitros de uma coloração de membrana plasmática fluorescente vermelha apropriada com as células e coloque as células de volta no bloco de calor. Após 5 minutos, lave as células adicionando 1,6 mililitros de meio completo suplementado com HEPES fresco e centrífuga. Gire o tubo para identificar o glóbulo vermelho.
Usando uma ponta de pipeta de 1 a 1,5 mililitro, remova cuidadosamente o sobrenadante em dois volumes sem perturbar o pellet. Em seguida, misture 2.000 microlitros de meio completo suplementado com HEPES fresco com as células. Centrifugue e ressuspenda o pellet em 400 microlitros de meio. Em seguida, rotule o tubo PMS para Plasma Membrane Stain. No final da incubação de marcação de células peritoneais de 20 minutos, lave a lâmina com 1 mililitro de meio fresco completo suplementado com HEPES.
Para opsonizar os glóbulos vermelhos, adicione 1 microlitro de anticorpo monoclonal IgG2b anti-CD235a humano de camundongo ao tubo de amostra de TPM. Após 8 minutos a 37 graus Celsius com mistura uma vez por minuto, transfira 100 microlitros de glóbulos vermelhos humanos corados com membrana plasmática e opsonizados por IgG para a lâmina do canal contendo macrófagos peritoneais. Assim que os glóbulos vermelhos humanos forem adicionados, monte a lâmina em um microscópio confocal de disco giratório com a incubadora de platina ajustada para 37 graus Celsius e, imediatamente, comece a obter imagens das células.