JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Comece adicionando quimioatraentes, como uma quimiocina, em uma placa multipoços.
Coloque uma câmara permeável ao poço de um tamanho de poro apropriado. Adicione a suspensão de células natural killer, ou NK, à câmara superior e incube.
Algumas moléculas de quimiocinas se difundem através da membrana e se ligam aos receptores das células NK. Isso desencadeia vias de sinalização que promovem alterações no citoesqueleto, resultando em movimento celular direcional em direção à maior concentração de quimioatraente na câmara inferior.
Após a incubação, transfira um volume fixo de células migradas da câmara inferior para uma classificação de células ativada por fluorescência ou tubo FACS. Adicione um número predeterminado de contas de contagem fluorescentes e execute a contagem de células baseada em FACS.
Usando a fórmula a seguir, determine o número absoluto de células NK migradas na amostra.
O gráfico de pontos fornece o número de contas de contagem e células separadas como regiões distintas, com base em suas propriedades de fluorescência e dispersão.
Para medir a migração de células NK em resposta a estímulos quimiotáticos, colete células NK humanas de uma cultura confluente de 70% a 80% e ressuspenda as células em uma concentração de 2,5 x 106 células por mililitro de meio de cultura de células NK sem soro. Em seguida, adicione 600 microlitros de meio sem soro contendo o quimioatraente de células NK de interesse por poço.
E coloque uma inserção de cultura de 6,5 milímetros de diâmetro com poros de 5 micrômetros em cada poço de meio. Em seguida, adicione 100 microlitros de células NK ao compartimento superior de cada inserto e coloque a placa na incubadora de cultura de células por quatro horas.
No final da incubação, transfira todo o volume de células migradas não aderentes do fundo de cada poço para tubos FACS individuais de 5 mililitros e adicione 15 microlitros de um número predeterminado de contas de contagem de citometria de fluxo a cada tubo. Em seguida, usando um citômetro de fluxo, avalie cada amostra de célula de acordo com os protocolos padrão de análise de citometria de fluxo e calcule o número absoluto de células NK migradas usando a fórmula.