Análise da Eferocitose de Timócitos Apoptóticos por Macrófagos Peritoneais

A eferocitose é o processo pelo qual as células fagocíticas eliminam as células apoptóticas.

Para analisar a eferocitose, obtenha timócitos de camundongo suscetíveis à apoptose. Incubar com corante CFSE permeável a células.

As esterases intracelulares clivam a CFSE em corante fluorescente impermeável às células, corando os timócitos. Adicione soro inativado por calor para evitar manchas excessivas.

Coloque os timócitos corados em uma placa de cultura. Adicione a estaurosporina, um inibidor da proteína quinase, que interrompe a cascata crítica de sinalização celular, induzindo a apoptose. Além disso, os resíduos de fosfatidilserina se translocam para o folheto externo da membrana celular, funcionando como "sinais de coma-me".

Adicione concentrações crescentes de timócitos apoptóticos a poços de placas de vários poços contendo macrófagos peritoneais de camundongos ativados, que expressam tirosina quinases de receptores específicos.

Essas quinases se ligam à fosfatidilserina exposta nos timócitos apoptóticos, facilitando sua internalização pelos macrófagos.

Pós-incubação, remova os timócitos apoptóticos flutuantes. Adicione anticorpos anti-CD11b marcados com fluoróforo, que se ligam às moléculas CD11b dos macrófagos.

Usando um microscópio de fluorescência, observe timócitos apoptóticos fluorescentes dentro de macrófagos fluorescentes diferentes, indicando eferocitose.

Poços com maiores concentrações de timócitos apoptóticos apresentam timócitos internalizados aumentados.

Para colher timócitos após abrir a cavidade torácica de um camundongo C57 / Black-6 ingênuo, use uma pinça curva de ponta fina para retirar o timo. Coloque o órgão em uma placa de cultura de tecidos contendo 10 mililitros de meio RPMI-1640. Triture todo o timo contra as extremidades foscas de 2 lâminas de microscópio e filtre a suspensão de tecido resultante através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Coletar os timócitos por centrifugação e ressuspender o pellet em 40 mililitros.

Após a contagem, centrifugue as células novamente e ressuspenda até 2 x 10⁸ células em 20 mililitros de PBS fresco por tubo de 50 mililitros. Rotule as células com CFSE 5-micromolar em 20 mililitros de PBS por tubo. Inverta os tubos duas a três vezes para misturar, antes de incubar os timócitos por no máximo 2 minutos em temperatura ambiente, protegidos da luz. No final da incubação, pare a reação com 10 mililitros de soro de cavalo inativado pelo calor e colete as células por centrifugação.

Ressuspenda as células marcadas em 40 mililitros de PBS fresco para contagem e centrifugação, seguido de uma lavagem adicional com 40 mililitros de meio. Após a lavagem do meio, ressuspenda os timócitos em uma concentração de 7 x 10⁶ células por mililitro de meio de cultura de tecidos e semeie as células em uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros. Em seguida, adicione estaurosporina à cultura de células em uma concentração final de 1 micromolar e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por 4 horas.

Para isolamento peritoneal de macrófagos, injete dois camundongos C57 / Black-6 por via intraperitoneal com 1 mililitro de tioglicolato envelhecido a 3% no dia 0, antes de abrir a pele abdominal sem perturbar o peritônio no dia 5.

Para lavar a cavidade peritoneal, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para empurrar rapidamente 10 mililitros de tampão de lavagem para dentro da cavidade antes de aspirar lentamente o tampão de lavagem para coleta em um tubo de 50 mililitros. Lave a gavagem peritoneal duas vezes com PBS. Ressuspenda os macrófagos peritoneais em uma concentração de 2 vezes 10 elevado à sexta células por mililitro de meio de cultura de tecidos.

Em seguida, semeie 500 microlitros de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por 2 horas. No final da incubação, aspire o sobrenadante para remover as células flutuantes e adicione 500 microlitros de meio de cultura de tecidos a cada poço.

Adicione imediatamente 0 a 12 x 10⁶ timócitos em 500 microlitros de meio a cada poço da cultura e coloque a placa na incubadora de cultura de tecidos por 4 horas. No final da incubação, lave cada poço duas vezes com PBS fresco para remover quaisquer células apoptóticas flutuantes, seguido por uma única lavagem com tampão de coloração. Em seguida, rotule os macrófagos ligados à placa com 200 microlitros de tampão de coloração suplementado com um anticorpo anti-CD11b apropriado por poço e coloque a placa a 4 graus Celsius por 20 minutos.