Um ensaio para citotoxicidade mediada por proteínas extracelulares bacterianas em PMNs

Pegue uma cultura de Staphylococcus aureus, uma bactéria patogênica que secreta leucocidina - uma toxina formadora de poros - composta por componentes monoméricos S e F.

Pulverize as células e dilua em série o sobrenadante. Transfira o sobrenadante contendo leucocidina para uma microplaca com leucócitos polimorfonucleares, ou PMNs, e incuba.

O componente S se liga a receptores transmembranares específicos em PMNs, seguido de hetero-oligomerização com o componente F para inserir na membrana celular, resultando na formação de poros.

O poro causa uma diminuição nos íons de potássio intracelulares, ativando a proteína 3 ou NLRP3 contendo domínio de pirina da família NLR.

NLRP3 liga-se à proteína semelhante a uma mancha associada à apoptose contendo um domínio de recrutamento de caspase, ou ASC, que recruta pró-caspase-1, formando um inflamassoma.

A autoproteólise converte a pró-caspase-1 em caspase-1 ativa, desencadeando a morte celular.

Colha as células em intervalos definidos. Adicione iodeto de propídio ou PI, que entra nas células mortas através de membranas danificadas para se ligar ao DNA, emitindo fluorescência.

Usando citometria de fluxo, quantifique as células coradas com PI p