JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:35 min • July 8th, 2025
Pegue cepas virulentas e menos virulentas de Staphylococcus aureus.
Adicione soro para opsonizar as bactérias.
Transfira concentrações bacterianas crescentes para poços de placa de vários poços resfriados contendo neutrófilos. Baixas temperaturas impedem a ativação de neutrófilos.
Centrífuga para facilitar a fagocitose sincronizada.
Os receptores de neutrófilos se ligam às opsoninas, desencadeando a internalização bacteriana em fagossomos.
Em bactérias virulentas, o ambiente fagossomal desencadeia a expressão de toxinas citolíticas.
Essas toxinas formam poros, rompendo os fagossomos e comprometendo a integridade da membrana dos neutrófilos.
No entanto, as bactérias menos virulentas exibem expressão reduzida de toxinas citolíticas.
Após a incubação, separar os neutrófilos e transferi-los para tubos de citómetro de fluxo contendo corante fluorescente de iodeto de propídio (PI).
O corante entra nos neutrófilos com membranas comprometidas e mancha o DNA.
Usando um citômetro de fluxo, analise os neutrófilos para a coloração PI.
Um aumento dependente da concentração na proporção de neutrófilos PI-positivos após a fagocitose da cepa virulenta, em comparação com a cepa menos virulenta, indica a citotoxicidade da cepa virulenta contra neutrófilos.
Quando Staph aureus subcultivado atingir o crescimento exponencial médio, transfira 1 mililitro de bactérias cultivadas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue a 5000 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Lave S. aureus aspirando sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda as bactérias peletizadas em 1 mililitro de DPBS. Vortex as amostras por 30 segundos. Centrifugar as amostras a 5000 g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Para opsonizar Staph aureus, primeiro, ressuspenda o pellet bacteriano em 1 mililitro de soro humano a 20%. Em seguida, incube as amostras a 37 graus Celsius com agitação por 15 minutos. Lave Staph aureus opsonizado após centrifugação, como mostrado anteriormente. Dilua as cepas opsonizadas de Staph aureus para 1 x 108 unidades formadoras de colônias, UFCs por mililitro, com RPMI gelado. Vortex a amostra por 30 segundos e coloque no gelo.
Confirmar as concentrações de Staph aureus utilizadas para estes ensaios, plaqueando 1 a 10 diluições seriadas de bactérias em ágar. Delicadamente, adicione 100 microlitros por poço de cada cepa de Staph aureus, ou RPMI, para controles positivos e negativos aos PMNs em uma placa de 96 poços no gelo da etapa 1.14. Agite suavemente a placa para distribuir Staph aureus em poços.
Sincronizar a fagocitose centrifugando a placa a 500 g por oito minutos a 4 graus Celsius e incubar a placa a 37 graus Celsius, imediatamente após a centrifugação como tempo 0. Nos pontos de tempo desejados, coloque a placa no gelo e adicione 200 microlitros de DPBS gelada contendo 1 microlitro de iodeto de propídio a cada tubo de citometria de fluxo e, em seguida, transfira as amostras para o tubo correspondente.