JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 5:26 min • July 8th, 2025
Exponha um camundongo a gotículas de aerossol contendo Mycobacterium tuberculosis.
As bactérias atingem o lúmen dos alvéolos - os minúsculos sacos de ar dentro dos pulmões - contendo macrófagos.
Os receptores de reconhecimento de padrões de macrófagos se ligam aos padrões moleculares associados ao patógeno nas bactérias, desencadeando seu engolfamento em um fagossomo.
As bactérias engolfadas secretam proteínas especializadas, que rompem a membrana do fagossomo. As bactérias escapam para o citoplasma e se reproduzem.
Pós-infecção, anestesiar o rato. Administre intraperitonealmente um substrato repórter da enzima bacteriana β-lactamase para fluorescência da enzima repórter ou imagem REF.
O substrato atinge os alvéolos pulmonares através da circulação e entra nas células infectadas.
Ele penetra na membrana externa bacteriana para atingir o espaço periplasmático contendo β-lactamase.
O substrato contém um anel β-lactâmico conectando um fluorocromo e um supressor. Devido à proximidade, a fluorescência do fluorocromo é absorvida pelo extintor.
A β-lactamase hidrolisa o anel β-lactâmico, liberando o fluoróforo e resultando em emissão de fluorescência.
Imagem da fluorescência para avaliar a infecção micobacteriana.
Para prosseguir, carregue animais de peso conhecido na câmara de inoculação energizada. A câmara pode acomodar até 90 ratos. Em seguida, feche todas as travas da porta. Em seguida, conecte o nebulizador usando um grampo de aço. Em seguida, pressione o botão Iniciar na câmara e defina a taxa de fluxo de ar entre 3 e 5 litros por minuto.
O ar comprimido fluirá a cerca de 22 a 26 libras por polegada quadrada e, o mais importante, deve ser possível ver a névoa de inóculo na câmara. Após 15 minutos, uma luz vermelha na frente do painel de controle aparecerá e um sinal sonoro indicará o fim da corrida. Em seguida, pressione o botão de reinicialização para redefinir os temporizadores. Para liberar o vácuo, pressione o pequeno botão vermelho na porta da câmara.
Em seguida, abra a porta da câmara e devolva os ratos às gaiolas de suas casas. Daqui para frente, mantenha os animais na sala de contenção. Em seguida, devolva o frasco do recipiente de transporte ao gabinete de biossegurança. Lá, descarte a suspensão bacteriana restante em um recipiente de lixo designado. Em seguida, coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e feche o saco para transporte para a autoclave.
Para limpar a câmara, borrife as superfícies internas com fenol tamponado e etanol a 70%. Deixe essas soluções reagirem nessas superfícies por 10 minutos e, em seguida, limpe-as completamente. Descarte todos os lenços no lixo de risco biológico. Em seguida, autoclave o lixo, o recipiente de lixo e os frascos nebulizadores usados.
Transfira os animais para a sala de imagem. Lá, anestesiar um animal de acordo com o protocolo de texto e injetá-lo com substrato de contraste por injeção intraperitoneal. No software do sistema de imagem, inicialize o sistema e prossiga quando a barra de temperatura ficar verde. Depois de inicializar o sistema, coloque o mouse na câmara de imagem.
Certifique-se de que suas narinas estejam dentro do cone do nariz para que receba anestésico durante a imagem. Agora, volte para o computador. No painel de controle de aquisição, selecione fluorescência, transiluminação, para visualização de todo o animal, ou epi-iluminação para visualizar os tecidos pulmonares. Para um único mouse, defina o campo de view para B e o nível da lâmpada para alto.
Para a exposição, use tempo automático, binning médio e dois ou três para o F / Stop. Em seguida, defina o filtro de excitação para 745 nanômetros e os filtros de emissão de 780 a 840 nanômetros. Em seguida, vá para a configuração da sequência e selecione de 9 a 12 pontos de transiluminação na área de interesse. Agora, pressione o botão adquirir para coletar imagens.